星點設(shè)計－效應(yīng)面法優(yōu)化玄參提取工藝

周洪偉 郝麗靜 楊 勇 張 林 楊 桃 周 坤 吳曉丹

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，100102;2河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院;3北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

玄參為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根，其味甘、苦、咸，性微寒，功效清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)?，F(xiàn)代研究表明，玄參主要含環(huán)烯醚萜類、苯丙素苷類，尚含植物甾醇、有機酸類、黃酮類、三萜皂苷、揮發(fā)油、糖類、生物堿及微量的單萜和二萜成分等，其中哈巴俄苷在玄參中含量較高，是玄參的特征性有效成分［1～2］;哈巴苷與哈巴俄苷可調(diào)節(jié)免疫功能，保護血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有較廣泛的藥理活性［3－4］。本研究采用星點設(shè)計 － 效應(yīng)面法(CCDRSM)研究玄參中哈巴苷與哈巴俄苷的提取工藝，優(yōu)選的工藝簡便可行，為該方法在中藥提取工藝優(yōu)化中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

HPLC系統(tǒng):LC－10ATVP四元泵，DGU－14A脫氣機，CTO－10TVP柱溫箱，SPD －M10TVP檢測器，SIL－10ADVP自動進樣器，CLASS－VP色譜工作站(島津公司);AUW120D電子分析天平(島津)。

哈巴苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:111729－200603);哈巴俄苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:111730－201106);玄參藥材(購自保定北京同仁堂藥店有限責(zé)任公司);甲醇、乙腈(色譜純);純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 哈巴苷與哈巴俄苷的HPLC測定

2.1.1 色譜條件 Agilent eclipse XDB－C18柱(4.6mm ×250mm，5μm);乙腈為流動相 A，水為流動相B，按表1進行梯度洗脫;流速1mL·min－1;柱溫30℃;檢測波長哈巴苷210nm，哈巴俄苷278nm。

表1 流動相梯度洗脫方案

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥36h的哈巴苷與哈巴俄苷對照品18.48mg、18.14mg，分別置10mL量瓶中，加甲醇定容，即得哈巴苷與哈巴俄苷對照品儲備液。精密移取哈巴苷對照品儲備液2mL、哈巴俄苷對照品儲備液0.2mL，分別置于10mL量瓶中，加甲醇定容，即得哈巴苷與哈巴俄苷對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取玄參藥材粉末(過三號篩)0.5065g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，密塞，稱定重量，浸泡1h，超聲處理45min，放冷，再次稱定重量，用50%甲醇補足損失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 線性范圍 精密吸取哈巴苷對照品溶液1、2、4、8、10、20μL，哈巴俄苷對照品溶液 4、8、10、14、16、20μL，分別注入色譜儀，以峰面積(Y)對進樣量(X)進行線性回歸，得哈巴苷回歸方程:Y=296990X+20638，相關(guān)系數(shù):r=0.9999，線性范圍:0.370 ～7.393μg;哈巴俄苷回歸方程:Y=2769.6X+2984.7，相關(guān)系數(shù):r=1，線性范圍:145.1～725.6ng。

2.1.5 精密度試驗 取對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測得哈巴苷與哈巴俄苷的RSD分別為2.26%和0.22%。

2.1.6 準(zhǔn)確性試驗 哈巴苷加樣回收率為(96.77±2.33)%，RSD為2.41%(n=6)，哈巴俄苷加樣回收率為(96.40±2.30)%，RSD為2.39%(n=6)。

2.1.7 藥材含量測定 依2.1.1項下方法測定玄參藥材中哈巴苷和哈巴俄苷含量，哈巴苷含量為0.35%，RSD=1.47%(n=3)，哈巴俄苷含量為0.12%，RSD=0.24%(n=3)。玄參藥材含量符合《中國藥典》一部(2010版)項下規(guī)定。

表2 因素水平表

表3 實驗設(shè)計與結(jié)果

2.2 玄參中哈巴苷與哈巴俄苷的提取工藝研究 在預(yù)實驗基礎(chǔ)上，選擇提取溶劑(%)X1、液料比X2和提取時間(min)X3為考察因素，以哈巴苷與哈巴俄苷總提取率(Y)為指標(biāo)進行CCD－RSM法優(yōu)化，實驗設(shè)計與結(jié)果見表2～表3。

采用Design－Expert 8.0軟件處理數(shù)據(jù)，有:

直線回歸方程為:

二元回歸方程為:

多元回歸方程為:

由以上方程可知，多元回歸方程的擬合效果最好。采用OriginPro 8.0軟件繪制三維效應(yīng)面圖，考察X1、X2、X3三個因素對Y的影響，如圖1所示。

圖1 星點設(shè)計－效應(yīng)面圖

2.3 最優(yōu)工藝驗證 由CCD－RSM法優(yōu)選玄參的提取工藝條件為:X1=18% ～32%，X2=20∶1 ～26∶1，X3=30～48min;按優(yōu)選工藝提取玄參藥材3批，依2.1項下方法測定其總提取率，結(jié)果見表4，數(shù)學(xué)模型滿足預(yù)測要求。

表4 玄參藥材總提取率驗證結(jié)果(n=3)

3 討論

目前中藥提取工藝優(yōu)化多采取正交設(shè)計或均勻設(shè)計法，這兩種方法多采用線性數(shù)學(xué)模型，實驗次數(shù)較少，精度不高。效應(yīng)面法系通過描繪效應(yīng)對考察因素的效應(yīng)面，從效應(yīng)面選擇較佳的效應(yīng)區(qū)，從而回推自變量取值范圍即最佳實驗條件的一種研究方法。實驗設(shè)計可采用星點設(shè)計，該方法適用于非線性模型擬合，且具有良好的預(yù)測性［5］。本實驗引入星點實驗設(shè)計方法，結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)選玄參中哈巴苷與哈巴俄苷的提取工藝，取得了良好的效果。

［1］胡瑛瑛，黃真.玄參的化學(xué)成分及藥理作用研究進展［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，32(2):268 －270.

［2］季金玉，張云，叢曉東，等.玄參的化學(xué)成分及質(zhì)量控制研究進展［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28(12):2507 －2510.

［3］謝麗華，劉洪宇，錢瑞琴，等.哈巴苷與哈巴俄苷對陰虛小鼠免疫功能及血漿環(huán)化核苷酸的影響［J］.北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2001，33(3):283－284.

［4］崔忠生，邸科前，馬煥云.哈巴苷及哈巴俄苷對腎上腺素?fù)p傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用［J］.山東醫(yī)藥，2009，49(25):60 －61.

［5］吳偉，崔光華，陸彬.實驗設(shè)計中多指標(biāo)的優(yōu)化:星點設(shè)計和總評“歸一值”的應(yīng)用［J］.中國藥學(xué)雜志，2000，35(8):530 －533.