新型N-苯乙酰纈氨酰胺衍生物的“一鍋法”合成及其抑菌活性

趙 建, 寧 君, 蔣志福, 高貝貝, 袁會珠, 折冬梅

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所 農(nóng)業(yè)部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

天然L-氨基酸的酰胺類衍生物因結(jié)構(gòu)簡單、低毒、低殘留、易降解而受到人們的廣泛關(guān)注[1]。氨基酸酰胺類衍生物在農(nóng)藥領(lǐng)域可用作除草劑[2]、殺菌劑[3～6]、殺蟲劑[7]以及植物生長調(diào)節(jié)劑[8]。其中用于殺菌劑的品種較多。目前氨基酸類殺菌劑研究的熱點(diǎn)是纈氨酰胺類衍生物(Chart 1)。該類化合物優(yōu)良的殺菌活性引起了人們的廣泛興趣，它是一類專門防治植物卵菌綱病害(腐霉除外)的結(jié)構(gòu)新穎的農(nóng)用殺菌劑[9]。纈氨酰胺的殺菌劑品種如纈霉威、苯噻菌胺、valifenalate等均已在國外廣泛用于多種作物的卵菌綱病害的防治[10]。

在植物和微生物代謝過程中，苯乙酸是由苯丙氨酸脫氨基得到，具有很強(qiáng)的殺菌功能[11]。苯乙酸及其鈉鹽在體內(nèi)和體外對辣椒疫霉及其它卵菌綱疫霉屬病害都有良好的防治效果，最低抑菌濃度(MIC)可達(dá)10 mg·L-1[12]。防治卵菌綱病害有特效的苯基酰胺類殺菌劑如苯霜靈以及高效、廣譜的β-甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑嘧菌酯等化合物亦都含有苯乙?；慕Y(jié)構(gòu)。研究表明，β-甲氧基丙烯酸脂類殺菌劑的藥效基團(tuán)——與苯環(huán)相連的β-甲氧基丙烯酸脂結(jié)構(gòu)中的羰基氧原子是用來與酶結(jié)合從而具備抑菌活性[13]。

為了尋找較高活性的農(nóng)藥先導(dǎo)化合物，本文根據(jù)活性基團(tuán)拼接原理，在L-纈氨酸(1)的N-端引入苯乙酰基，C-端由各種伯胺(4a～4g)閉合，設(shè)計(jì)并合成了7個未見文獻(xiàn)報道的纈氨酰胺類衍生物——N-苯乙酰纈氨酰胺衍生物(5a～5g, Scheme 1)。以1為起始原料，三乙胺為?；瘎?，在液-液兩相反應(yīng)體系中通過混合酸酐法“一鍋”合成5a～5g,其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR, IR和HR-MS表征。應(yīng)用生長速率法對其生物活性進(jìn)行了初步測試，結(jié)果表明，5對卵菌綱疫霉屬病菌有一定的抑菌活性，其中5e在給藥量為50 mg·L-1時，對黃瓜疫霉病菌的抑制率49.2%。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

X-4型數(shù)字顯示熔點(diǎn)儀(溫度計(jì)未校正);Bruker DRX FT-NMR 300 MHz型超導(dǎo)核磁儀(DMSO-d6為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo));Thermo Nicolet 6700 FT-IR型紅外光譜儀(KBr 壓片);Bruker Apex IV FTMS型傅里葉變換高分辨質(zhì)譜儀。

1,生化試劑;其余所用試劑均為化學(xué)純或分析純。

1.2 5a～5g的合成通法

在反應(yīng)瓶中依次加入水7 g, 45%NaOH溶液4.13 g和1 2.31 g(19 mmol),攪拌至形成透明溶液;于室溫滴加苯乙酰氯3.71 g(24 mmol),滴畢，反應(yīng)1 h;用37%鹽酸中和過量的NaOH。加入Et2N 3滴和乙酸乙酯42 mL，再反應(yīng)30 min;加入氯甲酸異丙酯2.48 g(20 mmol),反應(yīng)1 h(生成混合酸酐);滴加RNH2(4a～4g) 20 mmol的乙酸乙酯(8.4 mL)溶液(逐漸有白色固體析出),滴畢，滴加10%NaOH溶液7.6 g，反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC跟蹤)。抽濾，濾餅用少量水洗滌，干燥得白色固體5a～5g(5e為白色粉末)。

5a: m.p.190 ℃～191 ℃;1H NMRδ: 0.80(d,J=6.81 Hz, 3H, CH3), 0.87(t,J=6.75 Hz, 3H, CH3), 1.09(d,J=6.90 Hz, 3H, CH3), 1.12(t,J=6.75 Hz, 3H, CH3), 1.94～2.00(m, 1H, CH), 3.58(s, 2H, CH2), 3.96～4.07(m, 1H, CH), 4.14(dd,J=7.20 Hz, 8.82 Hz, NCH), 5.98(br s, 1H, NH), 6.24(br s, 1H, NH), 7.25～7.37(m, 5H, PhH); IRν: 3 283, 2,969, 1 635, 1 541, 1 454, 1 383, 695 cm-1; HR-MSm/z: Calcd for C16H25N2O2{[M+H]+} 277.191 29, found 277.191 05。

5b: m.p.136 ℃～137 ℃;1H NMRδ: 0.80(t,J=6.75 Hz, 3H, CH3), 0.84(d,J=6.81 Hz, 3H, CH3), 0.88(d,J=6.72 Hz, 3H, CH3), 1.22～1.27(m, 2H, CH2), 1.29～1.43(m, 2H, CH2), 1.92～2.01(m, 1H, CH), 3.05～3.26(m, 2H, NCH2), 3.56(s, 2H, CH2), 4.26(dd,J=7.83 Hz, 8.73 Hz, 1H, CH), 6.69(br s, 1H, NH), 6.79(br s, 1H, NH), 7.22～7.35(m, 5H, PhH); IRν: 3 278, 2 960, 1 635, 1 545, 1 432, 1 385, 690 cm-1; HR-MSm/z: Calcd for C17H26N2O2{[M+H]+} 291.206 70, found 291.207 03。

5c: m.p.176 ℃～177 ℃;1H NMRδ: 0.80～0.91(m, 12H, CH3), 1.65～1.74(m, 1H, CH), 1.95～2.01(m, 1H, CH), 2.89～3.12(m, 2H, NCH2), 3.55(s, 2H, CH2), 4.28(dd,J=7.71 Hz, 8.82 Hz, 1H, CH), 6.70(br s, 1H, NH), 6.84(br s, 1H, NH), 7.24～7.33(m, 5H, PhH); IRν: 3 285, 2 959, 1 638, 1 541, 1 453, 1 385, 1 235, 696 cm-1; HR-MSm/z: Calcd for C17H27N2O2{[M+H]+} 291.201 24, found 291.201 27。

5d: m.p.234 ℃(分解);1H NMRδ: 0.81(d,J=6.79 Hz, 3H, CH3), 0.86(d,J=6.73 Hz, 3H, CH3), 1.01～1.69(m, 10H, CH2), 1.82～2.02(m, 1H, CH), 3.57(s, 2H, CH2), 3.63～3.76(m, 1H, CH), 4.21(dd,J=7.40 Hz, 8.68 Hz, 1H, CH), 6.26(br s, 1H, NH), 6.49(br s, 1H, NH), 7.24～7.35(m, 5H, PhH); IRν: 3 268, 2 962, 1 636, 1 554, 1 451, 1 368, 1 251, 694 cm-1; HR-MSm/z: Calcd for C19H29N2O2{[M+H]+} 317.222 35, found 317.222 10。

5e: m.p.165 ℃～166 ℃;1H NMRδ: 0.68(d,J=6.65 Hz, 3H, CH3), 0.72(t,J=6.65 Hz, 3H, CH3), 0.80(d,J=5.63 Hz, 3H, CH3), 1.62～1.77(m, 2H, CH2), 1.85～2.02(m, 1H, CH), 3.58(s, 2H, CH2), 4.32(dd,J=7.14 Hz, 1.82 Hz, 1H, CH), 4.71～4.81(m, 1H, CH), 6.70(br s, 1H, NH), 7.15～7.30(m, 10H, PhH), 7.32(br s, 1H，NH); IRν: 3 282, 2 964, 1 635, 1 549, 1 454, 1 382, 699 cm-1; HR-MSm/z: Calcd for C22H29N2O2{[M+H]+} 353.222 38, found 353.222 35。

5f: m.p.196 ℃～197 ℃;1H NMRδ: 0.84(d,J=6.78 Hz, 3H, CH3), 0.92(d,J=6.72 Hz, 3H, CH3), 2.04～2.11(m, 1H, CH), 2.30(s, 3H, CH3), 3.61(s, 2H, CH2), 4.46(dd,J=7.35 Hz, 8.73 Hz, 1H, CH), 6.41(br s, 1H, NH), 7.05～7.44(m, 9H, ArH, PhH), 8.62(br s, 1H, NH); IRν: 3 268, 3 025, 1 655, 1 529, 1 454, 1 258, 752, 700 cm-1; HR-MSm/z: Calcd for C20H25N2O2{[M+H]+} 325.191 05, found 325.191 17。

5g: m.p.195 ℃;1H NMRδ: 0.85(d,J=9.78 Hz, 3H, CH3), 0.90(d,J=6.73 Hz, 3H, CH3), 2.00～2.07(m, 1H, CH), 3.63(s, 2H, CH2), 4.61(dd,J=7.28 Hz, 8.34 Hz, 1H, CH), 6.65(br s, 1H, NH), 7.22～7.35(m, 9H, ArH, PhH), 9.36(br s, 1H, NH); IRν: 3 278, 2 960, 1 635, 1 545, 1 432, 1 385, 690 cm-1; HR-MSm/z: Calcd for C19H22N2O2Cl{[M+H]+} 344.136 43, found 344.136 90。

2 結(jié)果與討論

2.1 5的合成與表征

室溫下由氯甲酸異丙酯與N-苯乙酰纈氨酸(2)形成混合酸酐，再與4a～4g經(jīng)酰胺化反應(yīng)“一鍋法”制得5a～5g。酰胺鍵的形成屬于不飽和碳上親核取代反應(yīng)，親核試劑的活性強(qiáng)弱是能否順利形成酰胺鍵的關(guān)鍵。在本實(shí)驗(yàn)中，4a～4g的親核基團(tuán)-NH2受所連基團(tuán)的電負(fù)性不同的影響，親核性強(qiáng)弱有很大不同。由于脂肪伯胺的親核性要強(qiáng)于芳香族伯胺，支鏈脂肪胺的強(qiáng)于直鏈脂肪伯胺，直鏈脂肪伯胺強(qiáng)于脂環(huán)族伯胺親核性。我們通過比較投料后出現(xiàn)白色絮狀沉淀的時間和產(chǎn)率(Scheme 1)，發(fā)現(xiàn)4a～4g的親核性強(qiáng)弱符合上述結(jié)論。說明胺的堿性對反應(yīng)的速度和收率具有較大影響，堿性強(qiáng)的化合物反應(yīng)速度更快，收率更高。

本文參考文獻(xiàn)[14]方法選擇價格低廉的有機(jī)堿三乙胺作?；瘎?。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看來，三乙胺在本實(shí)驗(yàn)中是較好的?；噭?。在有機(jī)溶劑選擇上，考慮到反應(yīng)的環(huán)境友好性、后處理的便捷性、以及對胺的溶解性，優(yōu)先選擇低毒的乙酸乙酯，應(yīng)用到液-液兩相反應(yīng)體系中。同時，乙酸乙酯在水中有一定的溶解度，可以促進(jìn)兩相反應(yīng)的進(jìn)行,得到較高收率。

5的IR分析結(jié)果表明，-NH的伸縮振動吸收在3 290 cm-1～3 260 cm-1，苯環(huán)上的CH伸縮振動吸收在3 080 cm-1～3 030 cm-1，酰胺的羰基伸縮振動吸收在1 680 cm-1～1 635 cm-1， R不同吸收峰位置會略有差異，芳環(huán)上C=C伸縮振動吸收在(1 600， 1 580， 1 500， 1 540) cm-1附近。5的1H NMR分析結(jié)果表明，芳環(huán)上的質(zhì)子吸收峰位于7.2～7.4,兩個酰胺鍵的活潑氫出現(xiàn)在6.0～9.0，其中由纈氨酸氨基形成的酰胺鍵上的氫受纈氨酸手性碳上單氫的耦合作用，裂分為低矮的寬雙峰；同樣，纈氨酸手性碳原子上的氫受異丙基中單氫和酰胺鍵上氫相互耦合的影響，吸收峰常常裂分為dd峰。

2.2 5的抑菌活性

根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1156.2-2006),采用菌絲生長速率法對5進(jìn)行抑菌活性的初步篩選。利用含毒的胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基法對辣椒疫霉病菌、荔枝霜疫霉菌、黃瓜疫霉病菌和煙草黑脛病菌四種卵菌綱疫霉屬的病菌進(jìn)行了抑制效果測試， 結(jié)果見表1(DMSO為溶劑,藥液濃度50 mg·L-1,對照藥劑為L-纈氨酸、苯乙酸、纈霉威)。由表1可見，5對卵菌綱疫霉屬病害具有一定的抑菌活性。在藥液濃度為50 mg·L-1時，對四種疫霉屬病害效果均較好的5e對黃瓜疫霉病菌的抑制率達(dá)49.2%，但是與對照藥劑相比，仍有一定差距。從結(jié)構(gòu)與活性分析，產(chǎn)生這個結(jié)果的可能原因是：纈霉威等商業(yè)化的纈氨酰胺衍生物，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是纈氨酸的N-端與親脂性基團(tuán)相連，而C-端與帶有芳香環(huán)的脂肪胺相連。而5的化學(xué)結(jié)構(gòu)與之存在差異，造成其間生物活性的不同。從表1可初步推斷苯乙?；c纈氨酸N-端相連，沒起到增加活性的預(yù)期。5e的結(jié)構(gòu)不同于5a～5d,5f和5g，它的纈氨酸部分的C-端與α-苯丙胺相連，更接近纈霉威的結(jié)構(gòu)，因而活性較高，該結(jié)果可為先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供新的思路。當(dāng)然由于離體生物活性測定試驗(yàn)有其局限性，N-苯乙酰纈氨酰胺衍生物在活體條件下能夠降解成苯乙酸，因而此類化合物的需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)和進(jìn)行活性測定。

表 1 5對卵菌綱疫霉病菌的抑菌活性*Table 1 Inhibitory Activity of 5 against Phytophthora spp

*DMSO為溶劑,藥液濃度50 mg·L-1; A: 辣椒疫霉病菌, B: 荔枝霜疫霉菌, C: 黃瓜疫霉病菌, D: 煙草黑脛病菌

致謝:本文生物活性測定所用卵菌綱菌種由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院的劉西莉教授提供，在此表示衷心感謝!

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