人工脂質(zhì)體染色方法的探究

蘇偉，闞文靜，王紹華，彭方

(武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072)

0 引言

人工脂質(zhì)體是一種人工膜體系，可以形成單層膜，也可以是連續(xù)的雙層或多層復(fù)合脂質(zhì)組成的人工小球囊，直徑不等，約25～100 nm.科研工作者利用乙醇注入法[1]、薄膜分散法、超聲波分散法[2]、逆相蒸發(fā)法[3]、冷凍干燥法等多種方法成功地制備了人工脂質(zhì)體.脂質(zhì)體可以和細(xì)胞膜融合，將藥物或者小分子送入細(xì)胞內(nèi)部，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因或藥物制備.因此，脂質(zhì)體是一種良好的生物學(xué)材料，被廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[4-5]和藥學(xué)領(lǐng)域[6-8].1976年德國(guó)的馬普生物物理研究所創(chuàng)建了膜片鉗技術(shù)[9-10]，利用雙電極鉗制細(xì)胞膜電位，記錄離子通道的離子電流，反映了細(xì)胞膜單一的或多個(gè)的離子通道分子活動(dòng).膜片鉗技術(shù)廣泛地應(yīng)用到平面雙分子層、脂質(zhì)體等人工標(biāo)本上，對(duì)細(xì)胞膜離子通道進(jìn)行性質(zhì)鑒定及動(dòng)力學(xué)研究，以闡述離子通道與細(xì)胞膜相互作用的機(jī)制，因而對(duì)脂質(zhì)體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)有較高的要求.

脂質(zhì)體的制備對(duì)后續(xù)定性和定量實(shí)驗(yàn)有著重要作用，所以，在制備脂質(zhì)體的過程中，研究者需要找到一種觀察脂質(zhì)體的形態(tài)特征、預(yù)測(cè)脂質(zhì)體制備效果的方法.傳統(tǒng)研究方法中，電子顯微鏡成為觀察脂質(zhì)體的一種方法，但具有一定的局限性，只能觀察平面結(jié)構(gòu)，成本較高，且不能隨時(shí)觀察.本研究利用染色的方法對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行觀察，通過不同染色方法的對(duì)比，將染色效果最佳的方法進(jìn)行優(yōu)化，從而能夠在光學(xué)顯微鏡下觀察到立體結(jié)構(gòu)清晰、形態(tài)完整的脂質(zhì)體.該方法簡(jiǎn)單、可行.目前對(duì)脂質(zhì)體染色的研究尚少見報(bào)道，本研究對(duì)脂質(zhì)體的染色進(jìn)行了探究，建立了一種觀察脂質(zhì)體的新方法，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要打下基礎(chǔ).

1 材料和儀器

1.1材料L-α-phosphatidylcholine(L-α-磷脂酰膽堿)(sigma)，氯化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR)，結(jié)晶紫(沈陽試三生化科技開發(fā)有限公司)，美藍(lán)(上海易利生物科技有限公司)，復(fù)紅(北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司)，鉬藍(lán)，蘇丹黑(沈陽市試劑三廠).

1.2試劑1%的結(jié)晶紫染液，0.01%的美藍(lán)染液，復(fù)紅染液，鉬藍(lán)染液，蘇丹黑染液參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》進(jìn)行配制，蒸餾水，三氯甲烷(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR).

1.3儀器玻璃珠，試管，搖床，烘箱，顯微鏡(Olympus BX51).

2 方法

2.1脂質(zhì)體的制備取1 μgL-α-phosphatidylcholine于試管中，加入1 mL氯仿、一粒玻璃珠，待固體磷脂完全溶解后，氮?dú)獯蹈?，加入濃度依次?%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、3.0%的1 mL氯化鈉溶液，分別編號(hào)為a1、a2、a3、a4、a5、a6.將樣品放入42 ℃搖床，50 r/min，過夜.

2.2脂質(zhì)體染色將一滴脂質(zhì)體樣品溶液置于載玻片中央，加蓋玻片，在普通光學(xué)顯微鏡、相差顯微鏡下直接觀察；分別取5 μL染液(1%的結(jié)晶紫染液，0.01%美藍(lán)染液，復(fù)紅染液，鉬藍(lán)染液，蘇丹黑染液)于樣品溶液(30 μL)中，混勻，鏡檢.

2.3梯度染色取染色效果最佳的染液進(jìn)行梯度染色，30 μL樣品液中分別加入1、3、5 μL染液，混勻，鏡檢，尋求最優(yōu)的染色配比.

3 結(jié)果

表1 不同的染色液對(duì)脂質(zhì)體染色效果的對(duì)比

1，1%結(jié)晶紫染液；2，復(fù)紅染液；3，0.01%美藍(lán)染液；4，蘇丹黑染液；5，鉬藍(lán)染液.

“++”表示顯微鏡下，脂質(zhì)體的染色效果最佳；“+”表示顯微鏡下，可觀察的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)完整，著色良好，背景干凈，形態(tài)清晰，數(shù)量多；“-”表示顯微鏡下，可觀察的脂質(zhì)體無完整結(jié)構(gòu)，著色差，背景、形態(tài)模糊，數(shù)量少.

3.1不同染液對(duì)脂質(zhì)體的染色效果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘇丹黑染液和美藍(lán)染液不能使脂質(zhì)體著色，與未染色脂質(zhì)體鏡檢的結(jié)果區(qū)別不明顯；加入鉬藍(lán)染液后，顯微鏡下無法檢測(cè)到脂質(zhì)體，推測(cè)脂質(zhì)體被破壞；復(fù)紅染液使脂質(zhì)體著色，染色效果差；結(jié)晶紫染液染色效果最佳，結(jié)果見表1.結(jié)晶紫可能與外膜的極性基團(tuán)發(fā)生吸附作用，使脂質(zhì)體著色，具體的作用機(jī)制需進(jìn)一步探討.

3.2未染色與染色后的脂質(zhì)體普通光學(xué)顯微鏡下，可觀察到未經(jīng)染色的脂質(zhì)體形態(tài)，但是輪廓模糊，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清晰，結(jié)果見圖1A；相差顯微鏡下，脂質(zhì)體較易被觀察，缺點(diǎn)是個(gè)體形態(tài)模糊，形態(tài)小的脂質(zhì)體分辨率差，結(jié)果見圖1B，可觀察的脂質(zhì)體數(shù)量少.經(jīng)結(jié)晶紫染色后，可以觀察到的脂質(zhì)體的數(shù)量明顯增多，能夠清晰地辨別脂質(zhì)體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)(圖2A和圖2E)，脂質(zhì)體的立體結(jié)構(gòu)突出(圖2C和圖2D)，形態(tài)小的脂質(zhì)體清晰可辨(圖2B和圖2F).

3.3最佳染色配比30 μL樣品液中加入3 μL結(jié)晶紫染液的效果最佳，脂質(zhì)體染色效果明顯，背景不呈現(xiàn)紫色，干凈(圖2C和圖2D)；加入1 μL結(jié)晶紫染液，脂質(zhì)體著色效果不佳，背景清晰(圖2E和圖2F)；加入5 μL染液，脂質(zhì)體和背景呈紫色(圖2A和圖2B)，難于分辨立體結(jié)構(gòu)(表2).

圖1 未經(jīng)染色，顯微鏡100×油鏡下的脂質(zhì)體A，普通光學(xué)顯微鏡；B，相差顯微鏡.

圖2 經(jīng)結(jié)晶紫染色，普通光學(xué)顯微鏡100×油鏡下的脂質(zhì)A、B的染色配比，30 μL樣品液加入5 μL結(jié)晶紫染液，染液終濃度為0.14%；C、D的染色配比，30 μL樣品液加入5 μL結(jié)晶紫染液，染液終濃度為0.09%；E、F的染液配比，30 μL樣品液加入1 μL結(jié)晶紫染液，染液終濃度為0.03%.

結(jié)晶紫染液體積/μL脂質(zhì)體染色后的清晰程度顯微鏡下溶液背景的顏色1+-3++-5++

“++”表示脂質(zhì)體染色清晰度最佳；“+”表示脂質(zhì)體染色清晰，溶液背景呈紫色；“-”表示脂質(zhì)體染色后不清晰，溶液背景為無色.

4 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)通過幾種染色液以及不同濃度的染液對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行染色，從而建立一種觀察脂質(zhì)體的新方法，能夠在普通光學(xué)顯微鏡下利用結(jié)晶紫染色對(duì)脂質(zhì)體的形成和形態(tài)進(jìn)行簡(jiǎn)便可行的觀察.與未染色前相比，脂質(zhì)體立體輪廓清晰，可清晰分辨形態(tài)小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的脂質(zhì)體，從而顯示出脂質(zhì)體的形成效果，給后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要帶來便利.

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