UrotensinⅡ?qū)Υ笫笮呐K效應的作用機制探討

韓清華 劉文媛 李晨娟 王睿 史宏濤

UrotensinⅡ(尾加壓素Ⅱ，UⅡ)是最初從硬骨魚尾部的下垂體中被提取出的一種生長抑素樣多肽［1］，主要分布于心血管及神經(jīng)系統(tǒng)［2，3］，它的縮血管效應是內(nèi)皮素的 8～10倍［4］。Ames等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)的孤兒受體 G 蛋白偶聯(lián)受體14(G-protein coupled receptor 14，GPR14，UT)是 UⅡ的特異性受體。UⅡ與UT結(jié)合后，可產(chǎn)生多種生物學效應，如促進內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、心肌纖維細胞的增殖、強烈的收縮血管作用及心臟抑制等心血管效應。其作用途徑很多，可能有鈣(Ca2+)、磷脂酶、酪氨酸激酶、RhoA等因子參與［6］，但具體通過哪條信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮效應尚不清楚。本研究利用全細胞膜片鉗技術，觀察UⅡ?qū)Υ笫笮募〖毎鸏-型鈣電流的影響，并選用特異性 PKA拮抗劑-KT5720，研究KT5720對UⅡ作用的阻斷效應，進而闡明UⅡ作用于大鼠心臟效應的可能電生理機制及信號轉(zhuǎn)導通路。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠，♂，體重200～250 g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。主要試劑:UrotensinⅡ(human)與KT5720購自英國TOCRIS公司;?；撬?taurine)、L-谷氨酸(L-glutamic acid)、乙二醇四乙酸(EGTA)、HEPES(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid)均購自美國Sigma公司;膠原酶P(Collagenase P)購自德國Bochringer Mannhein公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 單個心室肌細胞的急性分離 取大鼠擊頭致昏，迅速剪斷頸部放血，開胸取出心肺，立即置于0℃氧飽和的無鈣臺式液中修剪，然后將心臟掛在Langendorff灌流裝置上經(jīng)主動脈逆行灌流，流速2 ml/min。先用無鈣臺式液灌流7～8 min，再用酶液循環(huán)灌流15～20 min。灌流過程中保持37℃恒溫，灌流壓為70 cmH2O，并持續(xù)通以100%氧氣。待心臟組織變大、變軟后將左心室肌組織剪下來，置于KB液中輕柔吹打，得到分散的心室肌細胞，經(jīng)150 μm孔徑的濾網(wǎng)過濾后保存于KB液中，室溫下穩(wěn)定1 h后，放入4℃冰箱靜置2 h備用。

1.3 全細胞膜片鉗記錄 實驗前先將存放于KB液中的心室肌細胞復鈣，復鈣終濃度為1.8 mmol/L。吸取適量細胞懸液滴加于灌流槽中，放置5～10 min使細胞牢固貼壁后，用細胞外灌流液以1～2 ml/min勻速灌流，使細胞逐漸復鈣，10～20 min后，于倒置相差顯微鏡下選擇貼壁牢固、無跳動、橫紋清晰、折光性好、立體感強的細胞進行實驗。玻璃微電極由PP-83型二步拉制儀(Narishige Co，Japan)拉制而成，充灌電極內(nèi)液后，電極電阻為2～5 mΩ。用微電極操縱器(Narishige Co，Japan)將電極推向細胞，負壓吸引形成高阻封接，電擊破細胞膜，補償電容電流和串聯(lián)電阻，形成全細胞記錄模式記錄ICa-L。細胞破膜后5 min開始記錄Ica-L，電流值以電流密度(pA/pF)表示。以上記錄均在室溫下進行。信號經(jīng)Axopatch-200B膜片鉗放大器放大、Digidate 1322A模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換，通過pClamp8.2軟件進行數(shù)據(jù)采集、儲存及分析。

L-型鈣電流記錄:在全細胞模式下，用TEA-Cl、CsCl阻斷電壓依賴性的Ik，從鉗制電位-40 mV開始，以10 mV步階逐步去極化至+50 mV，電壓刺激時程為300 ms，刺激頻率為0.1 Hz激活Ica-L。心肌細胞分離及全細胞電流記錄方法參照文獻。

1.4 溶液組成 臺氏液(mmol/L):KCl 5.4;NaH2PO40.33;HEPES 5.0;Glucose 10.0;MgCl21.0;NaCl 140;CaCl21.8;用NaOH調(diào)pH值到7.35～7.40。無鈣臺氏液:去除鈣離子的臺式液。酶液(mmol/L):KCl5.4;NaH2PO40.33;HEPES 5.0;Glucose 10.0;MgCl21.0;NaCl 125;Taurine 20.0;CaCl275 μmol/L;膠原酶P 5～7 mg。KB液(mmol/L):L-谷氨酸50.0;KCl 30.0;?；撬?0.0;KH2PO430.0;HEPES 10.0;Glucose 10.0;MgCl21.0;EGTA 0.5;用KOH調(diào)pH值到7.35～7.40。

L-型鈣電流(Ica-L)的電極內(nèi)液(mmol/L):KCl 150;HEPES 5.0;EGTA 5.0;K2ATP 3.0;MgCl21.0;4-AP 5.0;MgATP 1.0，;用KOH調(diào)pH值到7.3。細胞外灌流液為臺式液。

1.5 統(tǒng)計學處理 原始數(shù)據(jù)經(jīng)Clampfit處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示。兩樣本均數(shù)間比較用t檢驗，多個樣本均數(shù)間比較用方差分析。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 UⅡ?qū)Υ笫笮募〖毎鸌ca-L的影響

2.1.1 不同濃度的UⅡ?qū)Υ笫笮募〖毎鸌ca-L的影響 10-9～10-5mol/L UⅡ灌流5 min后，UⅡ呈濃度依賴性的抑制大鼠心肌細胞Ica-L，10-6和10-5mol/L UⅡ的下降率明顯大于對照組(P＜0.01，n=10)(圖1)。

圖1 10-9～10-5mol/L UⅡ灌流后，UⅡ呈濃度依賴性的抑制大鼠心肌細胞Ica-L

2.1.2 不同濃度UⅡ?qū)Υ笫笮募〖毎鸏-型鈣電流密度的影響(表1，圖2)

表1 不同濃度UⅡ?qū)Υ笫笮募〖毎鸏-型鈣電流密度的影響

2.2 KT5720對UⅡ作用于大鼠心肌細胞Ica-L的影響(圖2)。

圖2 灌流KT-5720基礎上給予UⅡIca-L變化不明顯

3 討論

UⅡ是迄今為止發(fā)現(xiàn)的收縮血管活性最強的物質(zhì)，可引起心功能抑制、心肌收縮力減弱等心血管效應。因此，UII對心血管系統(tǒng)的效應仍是當今研究的熱點。本課題組在前期研究中，利用Langendorff離體大鼠心臟模型，用不同濃度的UⅡ(10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)依次灌注正常大鼠心臟，±dp/dtmax抑制率隨濃度增加而增大，呈劑量依賴性抑制作用。

為進一步探討UⅡ作用于心臟的電生理機制，本研究采用全細胞膜片鉗技術，觀察到UⅡ呈濃度依賴性的抑制大鼠左心室心肌細胞Ica-L。正常狀態(tài)下心室肌細胞L-型鈣通道開放，細胞外Ca2+內(nèi)流，通過細胞內(nèi)Ca2+誘導的鈣釋放機制引起鈣池釋放鈣，從而使胞漿內(nèi)Ca2+水平升高，引起心肌收縮。在本實驗中我們觀察到UⅡ能減弱心肌細胞L-型鈣電流強度，抑制細胞外鈣離子內(nèi)流，進而降低細胞內(nèi)Ca2+濃度，從而抑制心肌收縮。因此我們推測UⅡ?qū)π墓δ艿囊种谱饔檬桥c抑制鈣電流有關。

目前研究顯示UⅡ與其受體結(jié)合后的作用途徑很多，可能有鈣(Ca2+)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)、磷酸肌醇、酪氨酸激酶、小型的 GTP酶RhoA及效應器Rho激酶-RhoK等因子參與，但具體通過哪條途徑發(fā)揮效應尚有爭議，因此UⅡ?qū)π难芟到y(tǒng)的作用轉(zhuǎn)導機制尚不清楚。本研究選用特異性PKA拮抗劑-KT5720，在單個心肌細胞L-型鈣電流的記錄中，觀察到在灌流KT-5720基礎上給予UⅡ，L-型鈣電流密度峰值變化不明顯，表明KT-5720可阻斷UⅡ?qū)︹}電流的抑制作用。由此我們推測，UrotensinⅡ可能通過PKA途徑抑制心肌細胞L-型鈣電流而發(fā)揮其心功能抑制作用。

UⅡ作為收縮血管活性最強的物質(zhì)，目前已成為心血管疾病治療的潛在的靶點。但是UⅡ作用非常廣泛而且復雜，其生物學作用還有待于進一步的研究。

［1］David P.Johne S，Brianr C.et al.Urotensin Ⅱ:A somatostatinlike peptide in the caudal neurosecretory system of fishes.Proc Natl Acad Sci，1980，77(8):5021.

［2］Zhu Y C，Zhu Y Z，Moore P K.The role of urotensin II in cardiovascular and renal physiology and diseases.Br J Pharmacol，2006，148(7):884-901.

［3］Zhu X M，Du G H.Progress in the study of biological activities of urotensinⅡ.Chin Pharmacol Bull，2006，22(6):651-4.

［4］Tasaki K，Hori M，Ozaki H，Karaki H，Wakabayashi I.Mechanism of human urotensin II-induced contraction in rat aorta.J Pharmacol Sci，2004，94(4):376-83.

［5］Ames RS，Sarau HM，Chambers JK，et al.Human urotensinⅡis a potent vasoconstrictor and agonist for the orphan receptor GPR14.Nature，1999，402(6764):898-903.

［6］Maguire J J，Davenport A P.Is urotensin-Ⅱ the new endothelin?.Br J Pharmacol，2002，137(5):579-588.

［7］Yazawa K，Kaibara M，Ohara M，et al.An improved method for isol-ating cardiac myocytes useful for pathch-clamp studies.Jpn J Physiol，1990，40:157-163.