不同劑量的DEHP對子代大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

張晶瑩 宋昕恬 孟令儀

DEHP(鄰苯二甲酸二乙基己酯)屬于鄰苯二甲酯類化合物，是目前塑料工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的增塑劑之一，主要應(yīng)用于各種塑料產(chǎn)品如纖維素樹脂、聚乙烯和聚氯乙烯食品包裝材料和醫(yī)用材料的生產(chǎn)加工。目前，鄰苯二甲酸酯在自然環(huán)境中分布的范圍非常廣，幾乎無處不在。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有13種物質(zhì)在所有受測試者身上都被發(fā)現(xiàn)，含量最高的首推DEHP［1］，這種物質(zhì)可能導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)，影響生殖、妊娠和性功能。DEHP可以通過胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)聚集，也可直接作用于胎兒［2，3］。如果在孕期接觸DEHP，由于胎兒的血腦屏障尚未發(fā)育完成，DEHP可能通過胎盤進(jìn)入胎兒的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而影響到子代的腦發(fā)育，造成神經(jīng)毒性的損害［4］。DEHP可能會引起神經(jīng)毒性，但國內(nèi)外有關(guān)DEHP的神經(jīng)毒性及其機(jī)制的系統(tǒng)報道較少，本研究擬通過DEHP的胚胎期暴露研究DEHP對于子代大鼠神經(jīng)發(fā)育，初步探討不同劑量的DEHP對子代大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，為今后對DEHP的深入研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DEHP(分析純)，美國Sigma公司。玉米油，市售。

1.2 實(shí)驗動物分組與染毒 Wistar大鼠35只，其中雌性25只，雄性50只，體重200～250 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗中心提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK-(吉)2011-0004。動物自由飲水?dāng)z食，飼料由長春市億斯實(shí)驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，合格證號:SCXK-(吉)2010～0001。動物室溫度20～22℃，相對濕度55% ～65%，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，按體重隨機(jī)分為4組:對照組和低、中、高劑量組，每組6只。動物交配雌雄大鼠以1∶1同籠，次日晨于盤底及陰道檢查陰栓，查出陰栓者，記為妊娠0 d，母鼠編號稱重，在妊娠期7～16 d，高、中、低三劑量組每天經(jīng)口灌胃給予DEHP，給予DEHP的量均為1.0 ml/100 g BW，對照組經(jīng)口灌胃給予等量玉米油。同時進(jìn)行如下處理。對照組:給予母鼠對照物玉米油;高劑量組:染毒母鼠DEHP 1000 mg/kg;中劑量組:染毒母鼠DEHP 750 mg/kg;低劑量組:染毒母鼠DEHP 250 mg/kg。孕鼠產(chǎn)子后，單獨(dú)一籠哺養(yǎng)幼鼠。實(shí)驗時，每籠選取雌雄兩只子代大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測定。

1.3 仔鼠行為學(xué)改變的測定

1.3.1 跳臺實(shí)驗 實(shí)驗時，將離乳的子代大鼠置于箱中，自由活動5 min，然后將其置于安全臺上，箱底通電，觀察其跳臺的潛伏期(latency，L)并記錄5 min內(nèi)仔鼠跳下臺的次數(shù)，即錯誤次數(shù)(mistake，M)，此為訓(xùn)練成績，24 h后再測為測試成績。

1.3.2 避暗實(shí)驗 實(shí)驗時將離乳的子代大鼠頭部背對著洞口放入明室，仔鼠一進(jìn)入暗室立即受電擊，記錄仔鼠5 min內(nèi)進(jìn)入暗室的錯誤次數(shù)，此為訓(xùn)練成績，24 h后再測為測試成績。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 10.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。組間比較采用最小顯著差異法檢驗(LSD法)。

2 結(jié)果

2.1 DEHP對子代大鼠跳臺實(shí)驗的測定 如表1所示，跳臺實(shí)驗中高、中、低劑量組與對照組比較，錯誤次數(shù)明顯增多，平均潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退;高劑量組與中、低劑量組比較，子代大鼠錯誤次數(shù)明顯增多，潛伏期明顯縮短(P＜0.05)。

2.2 DEHP對子代大鼠避暗實(shí)驗的測定 如表2所示，高、中、低劑量組子代大鼠進(jìn)入暗箱的潛伏期縮短明顯低于對照組(P＜0.05)及子代大鼠5 min內(nèi)受電擊次數(shù)明顯高于對照組(P＜0.05)，說明高、中、低劑量組子代大鼠的記憶能力明顯降低;高劑量組子代大鼠進(jìn)入暗箱的潛伏期縮短與中、低劑量組比較有顯著性(P＜0.05);高劑量組子代大鼠進(jìn)入暗室的錯誤次數(shù)增多與低劑量組比較有顯著性(P＜0.05)。

表1 DEHP對子代大鼠跳臺測試結(jié)果的影響(±s)

表1 DEHP對子代大鼠跳臺測試結(jié)果的影響(±s)

注:a與正常對照組比較，P＜0.05;b與高劑量組比較，P＜0.05

組別 例數(shù) 跳臺法潛伏期(s)錯誤次數(shù)正常對照組12 95.47±9.16 3.00±1.21高劑量組 12 58.48±9.25a 7.75±1.22a中劑量組 12 78.60±11.98ab 7.00±1.21a低劑量組 12 85.91±10.69ab 5.73±1.19ab

表2 DEHP對子代大鼠避暗測試結(jié)果的影響

3 討論

DEHP可經(jīng)胃腸道、肺和皮膚吸收，通常以胃腸道為主要吸收途徑。進(jìn)入胃腸道后，DEHP受胰腺酶和腸道內(nèi)一些酶的作用，大部分迅速由雙酯轉(zhuǎn)化為單酯(MEHP)，然后被吸收。DEHP及其代謝產(chǎn)物主要分布于血液、肝臟、腎臟、胃腸道以及脂肪組織，其中在大鼠的睪丸組織中濃度相對較高。DEHP進(jìn)入體內(nèi)代謝的第一步就是水解成為單酯系列，主要在胃腸道進(jìn)行［5］。DEHP進(jìn)入體內(nèi)后被迅速降解，美國環(huán)境保護(hù)署報道，DEHP在人體內(nèi)的半衰期平均為12 h。Andral AJ［6］研究認(rèn)為DEHP孕期染毒可導(dǎo)致子代大鼠下丘腦視前交叉區(qū)芳香化酶表達(dá)降低，活性下降。有研究表明［7］隨著DEHP濃度增高，小鼠腦組織細(xì)胞DNA的損傷隨之加重，DEHP的濃度達(dá)到125 mg/kg和375 m/kg時，其可造成DNA的顯著斷裂(P＜0.01)。另研究表明，雌性大鼠妊娠期經(jīng)口灌胃DEHP染毒，可造成孕鼠著床數(shù)降低;胚胎數(shù)、活胎數(shù)減少?？梢奃EHP能夠通過胎盤屏障進(jìn)入胚胎體內(nèi)，影響胚胎發(fā)育，具有致畸性［8］。

DEHP可以通過胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)，在胎兒體內(nèi)聚集，動物實(shí)驗表明其具有致畸性，可直接作用于胎兒，也可通過干擾胎盤屏障影響胎兒發(fā)育［2，3］。導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常的機(jī)制目前尚不明確，已經(jīng)報道以下相關(guān)機(jī)制:①DEHP可以與過氧化物酶增殖體激活體(PPAR)作用，激活PPAR的亞型，影響胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞脂類物質(zhì)的代謝。②在器官形成的關(guān)鍵時期，DEHP通過影響與鋅代謝有關(guān)的基因:金屬硫蛋白-1(MT-1)、金屬硫蛋白-2(MT-2)、鋅運(yùn)轉(zhuǎn)體蛋白(ZnT-1)等的表達(dá)導(dǎo)致畸形。③可影響某些基因的表達(dá)，進(jìn)而影響胚胎發(fā)育。Hokanson等［9］在體外培養(yǎng)人類MCF-7細(xì)胞株，探討DEHP對基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明DEHP可以改變許多基因的表達(dá)，其中包括FGD1和PAFAH1B1，這兩個基因?qū)ε咛ゴ竽X發(fā)育非常重要，DEHP使這兩個基因表達(dá)下調(diào)，推測DEHP可能會影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育并使認(rèn)知功能發(fā)生障礙。本研究通過神經(jīng)行為學(xué)實(shí)驗方法結(jié)果顯示，跳臺實(shí)驗中高、中、低劑量組與對照組比較，錯誤次數(shù)明顯增多，平均潛伏期明顯縮短(P＜0.05);高劑量組與中、低劑量組比較，子代大鼠錯誤次數(shù)明顯增多，潛伏期明顯縮短(P＜0.05)。避暗實(shí)驗中高、中、低劑量組子代大鼠進(jìn)入暗箱的潛伏期縮短明顯低于對照組(P＜0.05)及子代大鼠5 min內(nèi)受電擊次數(shù)明顯高于對照組(P＜0.05);高劑量組子代大鼠進(jìn)入暗箱的潛伏期縮短與中、低劑量組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);高劑量組子代大鼠進(jìn)入暗室的錯誤次數(shù)增多與低劑量組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。說明DEHP對子代大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害有一定的影響，子代大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退。目前，對DEHP的神經(jīng)毒性機(jī)制尚無明確的結(jié)論，由于本次試驗的局限性，仍有待進(jìn)行更加深入的研究探討。

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