分光光度法測定蕪菁中總黃酮含量

梁永紅 阿提合尼木 海力茜·陶爾大洪 王松芝

維藥蕪菁的植物學(xué)名為蕪菁，來源于十字花科植物蕪菁的塊根，藥食同源，歷史悠久，療效顯著，可用支氣管炎，食欲不振，消化不良的治療。通過研究提示蕪菁藥材中含有皂苷，黃酮類，糖類及其苷，生物堿，內(nèi)酯，揮發(fā)油，酚類，鞣質(zhì)，氨基酸，蛋白質(zhì)等化學(xué)成分［1］，并且研究了多糖的提取及含量測定，而其他相關(guān)性研究尚在進行當中。

本實驗選用了新疆9個不同產(chǎn)地的蕪菁藥材，按照《中國藥典》(2005)的相關(guān)規(guī)定進行實驗并且采用熒光分析法對其總黃酮含量進行了測定［2］，旨在以評價藥材的質(zhì)量，并且為相關(guān)部門今后制定該藥材質(zhì)量標準時提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

SX721分光光度計﹙上海第三分析儀器廠﹚;索氏提取器;回流提取裝置。乙醇為分析純;5%亞硝酸鈉溶液，10%硝酸鋁溶液，4%氫氧化鈉溶液采用分析純試劑自配;蘆丁標準品﹙100080-200707，中國藥品生物制品檢定所﹚。樣品為新疆9個不同產(chǎn)地的蕪菁藥材

2 方法與結(jié)果

2.1 標準品溶液的制備［3］精確稱取在105℃條件下干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁標準品10.0 mg，置于100 ml容量瓶中，加入75%乙醇適量，微熱溶解解，放冷后再加入75%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.10 g/L的蘆丁對照品溶液，低溫保存，備用。

2.2 供試品溶液的制備［4］精密稱取蕪菁粉末1.0 g(過60目篩，60℃干燥至恒重)置索氏提取器中，加30 ml石油醚加熱回流30 min，棄去石油醚提取液，利用余溫揮干殘留石油醚，然后加入30 ml體積分數(shù)75%乙醇加熱回流120 min，過濾，濾液置100 ml容量瓶中，用75%乙醇定容至刻度。

2.3 測定波長的選擇 精確量吸取對照品溶液和供試品溶液5 ml，分別置于25 ml容量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加入10% 硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加4% 氫氧化鈉溶液10.0 ml，再加入75%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，在波長200～700 nm范圍內(nèi)進行不斷縮小范圍的反復(fù)連續(xù)波長掃描，以確定波長。

2.4 標準曲線繪制 分別精確量吸取蘆丁標準液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml置于 25 ml容量瓶中，加入 5%的亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加入10% 硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加入4% 氫氧化鈉溶液10.0 ml，再加入75%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，進樣，在確定的波長處測定吸光度值(以不加標準溶液的相應(yīng)溶液為空白對照)，得到標準液濃度(C)與吸光度(A)之間的回歸方程。

2.5 正交實驗設(shè)計 在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上采用索氏提取法在質(zhì)量，提取工藝相同條件下，考察了乙醇濃度，料液比，提取時間等因素的影響，采用正交表L9(34)安排實驗，見表1。精密稱取蕪菁粉末1.0 g于索氏提取器中進行正交實驗，精密吸取5 ml于25 ml容量瓶中按上述“2.3”方法制成測定液，測定其吸光度值。

表1 索氏提取因素水平表

2.6 回收率試驗［5］精密量取供試液1 ml，分別置于4只25 ml量瓶中，分別加入標準液 0.30，0.40，0.50，0.60 ml，再照“2.3”項的方法制成測定液，測定吸光度值，計算測定液總黃酮濃度，平均回收率及RSD值。

2.7 樣品含量測定 最佳提取條件下，照“2.2”項的方法制備成供試品溶液，精確量取供試品溶液5 ml，置25 ml容量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10.0 ml，再加入75%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以加標準溶液的相應(yīng)溶液為空白對照，在確定的波長處測定吸光度值(A)，代回歸方程計算總黃酮含量。

3 結(jié)果

3.1 提取溶劑和提取方法的選擇 因甲醇有毒，因此選用乙醇提取，用硝酸鋁顯色法，在波長510 nm處測定蕪菁中總黃酮的含量。

3.2 穩(wěn)定性試驗 測定結(jié)果表明，提取液中加入顯色劑制成測定液后穩(wěn)定性逐漸變差，得穩(wěn)定性試驗的RSD%為1.5%，須在45 min內(nèi)盡快測定為宜。提取液放置1 d后不穩(wěn)定，因此應(yīng)采用新鮮的提取液。

3.3 精密度、回收率試驗 精密度，回收率試驗的RSD值分別為0.85%(n=5)，1.6%(n=5)，平均加樣回收率為101.6%，表明波長為510nm的分光光度法適用于蕪菁中總黃酮的含量測定，該法操作簡便，結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好。

3.4 標準曲線繪制 按上述標準液制備及標準曲線的繪制方法，得到標準溶液濃度(C)和吸光度(A)間的回歸方程為:A=0.01853 c+0.0097，r=0.9998，表明該方程在 0 ～0.020 mg∕ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標準工作曲線

3.5 正交實驗結(jié)果 把吸光度(A)代入標準曲線方程求出樣品中總黃酮含量，結(jié)果詳見表2。

3.6 最佳條件的選擇 從表2和表3的數(shù)據(jù)可知，3種因素對提取結(jié)果影響大小依次為A＞B＞C。表2可知最佳提取方案為A1B3C3，但由表3可知C因素沒有顯著性差異，從成本考慮，最佳提取方案為A1B3C1。即最佳提取條件為用30倍原料重的75%乙醇提取120 min。在此條件下，按上述方法顯色，測定其吸光度，由標準曲線計算出總黃酮質(zhì)量分數(shù)為2.603%。

3.7 不同產(chǎn)地蕪菁總黃酮含量(%)

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果表

表3 正交試驗結(jié)果的方差分析

表4 不同產(chǎn)地蕪菁總黃酮含量(%)

4 討論

本實驗首次采用分光光度法對新疆9個不同產(chǎn)地的蕪菁的塊根進行總黃酮含量的測定，測定結(jié)果見表4。從表中可以看出，各產(chǎn)地總黃酮含量均高于2.0%，故將總黃酮含量暫定為不得低于2.0%。最后確定的總黃酮最佳提取工藝是用30倍原料重的75%乙醇提取120 min。新疆不同地區(qū)蕪菁中總黃酮含量有明顯的不同，其中阿克蘇地區(qū)的蕪菁中總黃酮含量最高，其次是和靜的，吐魯番地區(qū)蕪菁中總黃酮含量最低，本實驗可為新疆的蕪菁產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

［1］李愛華，侯寶林，泰西京，等.新疆阿克蘇恰麻古多糖的提取及含量測定.新疆師范大學(xué)學(xué)報，2009，28(2):61-63.

［2］中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:152-153.

［3］曠南岳，海力茜.維藥蕪菁藥材質(zhì)量標準研究.西北藥學(xué)雜志，2010，25(6):421-423.

［4］海力茜·陶爾大洪，巴吐爾.天山巖黃芪根中總黃酮超聲提取工藝研究.時珍國醫(yī)國藥，2008，19(2):82-83.

［5］馬合木提，海力茜.紫外分光光度法測定維藥鷹嘴豆中總黃酮的含量.時珍國醫(yī)國藥，2007，19(4):889-890.