大鼠低攝鈣相關(guān)性高草酸尿癥模型的建立

田 晶，郭宏騫，孫西釗，孫則禹，魯?shù)律?/p>

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬鼓樓醫(yī)院 1急診科 2泌尿外科，南京 210008

·論著·

大鼠低攝鈣相關(guān)性高草酸尿癥模型的建立

田 晶1，郭宏騫2，孫西釗2，孫則禹2，魯?shù)律?

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬鼓樓醫(yī)院1急診科2泌尿外科，南京 210008

目的建立大鼠低攝鈣相關(guān)性高草酸尿癥模型并進(jìn)行初步探討。方法健康雄性 SD 大鼠24只，用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計法分為低劑量鈣組、中等劑量鈣組及高劑量鈣組，連續(xù)喂養(yǎng)3 d，各組大鼠在3 d內(nèi)分別依次給予劑量遞減的飲食鈣。測量大鼠每天的24 h尿量、尿草酸濃度、尿肌酐濃度并計算24 h尿草酸總排泄量。其中，尿草酸濃度用高效液相色譜法檢測，尿肌酐濃度用自動生化分析儀檢測。結(jié)果24 h尿草酸總排泄量隨時間變化而變化(F=7.893,Plt;0.01)；時間因素與分組因素之間無交互作用(F=1.142,Pgt;0.05)；24 h尿草酸總排泄量隨分組變化而變化(F=3.565,Plt;0.05)。3組大鼠第3天的24 h尿草酸總排泄量均顯著高于第1天(Plt;0.05)。結(jié)論通過控制飲食鈣攝入水平，成功建立了大鼠低攝鈣相關(guān)性高草酸尿癥模型。

草酸鈣結(jié)石；飲食鈣；高草酸尿癥；高鈣尿癥

ActaAcadMedSin,2012,34(2):134-137

我國是世界上泌尿系結(jié)石的三個主要流行地區(qū)之一，人群患病率為2%～5%[1]。草酸鈣結(jié)石是泌尿系結(jié)石的主要類型，約占全部尿石的78%和上尿路結(jié)石的90%以上。研究表明，我國是低鈣飲食國，鈣是我國居民膳食中最缺乏的營養(yǎng)素之一[2]。筆者認(rèn)為，由于國人長期低鈣飲食，引起腸中游離草酸吸收過多，導(dǎo)致尿草酸排泄增多，可導(dǎo)致“低攝鈣相關(guān)性高草酸尿癥”，從而提高尿中草酸鈣的過飽和度，最終增加草酸鈣結(jié)石發(fā)生的危險性。本研究試圖在大鼠體內(nèi)建立“低攝鈣相關(guān)性高草酸尿癥”模型并進(jìn)行初步探討。

材料和方法

主要試劑與儀器

儀器：大鼠代謝籠由蘇州楓橋凈化設(shè)備公司提供。東芝全自動生化分析儀由我院檢驗中心提供。Agilent 1100 型高效液相色譜儀,包括四元泵、在線脫氣機(jī)、可變波長檢測器、色譜工作站;臺式離心機(jī)TGL216G(上海安亭科學(xué)儀器廠) ;0122μm 孔徑微孔濾膜(上海市新亞凈化器件廠) ;雷磁PHS23C 型精密pH計(上海雷磁儀器廠) ;AG204 精密電子天平(瑞士)。

試劑：基礎(chǔ)飼料成分由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院實驗動物中心提供，其中纖維素為微晶纖維素，微量元素、碳酸鈣、草酸鈉等均為分析純。高效液相色譜法檢測所需草酸、磷酸二氫鉀、四丁基硫酸氫銨、磺基水楊酸均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

實驗動物及分組健康雄性SD大鼠24只，清潔級，體重173～216 g，由南通大學(xué)實驗動物中心提供，使用許可證號SCXK(蘇)2008-0010。實驗室環(huán)境密閉、有空調(diào)，實驗前進(jìn)行消毒，相對濕度60%，溫度(22±2)℃，照明時間為6:30～18:30。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計法，將大鼠分成低劑量鈣組、中等劑量鈣組和高劑量鈣組，每組8只。

飼料配方參照美國官方分析化學(xué)師協(xié)會[3]制定的大鼠精制飼料配方，屬于人工半合成飼料。將配方中的碳酸鈣成分去除，制成顆粒狀基礎(chǔ)飼料，其中，酪蛋白占20%，棉籽油占5%，玉米淀粉占63.81%，混合維生素占0.19%，混合無機(jī)鹽占5%，纖維素占5%，葡萄糖占1%。此基礎(chǔ)飼料不含草酸，未添加碳酸鈣，但其中玉米淀粉和棉籽油內(nèi)仍含微量的天然鈣，鈣含量總計約0.1255 mg/g飼料，遠(yuǎn)低于大鼠普通飼料含鈣標(biāo)準(zhǔn)，屬于低鈣無草酸飼料?；A(chǔ)飼料配方制成后，可依實驗要求對其中的碳酸鈣和草酸鈉含量進(jìn)行增減。本研究3 d內(nèi)各組大鼠飼料中的Na2C2O4的含量均為0.7482 mg/g，而CaCO3的含量則隨時間而遞減(表1)。

尿液處理代謝籠分別收集3組大鼠第1～3天內(nèi)的24 h尿液，裝于聚丙烯瓶中。按鹽酸∶尿=1∶100加75%濃鹽酸，立即用高效液相色譜法測定尿草酸濃度。當(dāng)日未測完者于4℃冰箱保存。

實驗方法實驗開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周，兩周后將大鼠分裝于不銹鋼代謝籠內(nèi)，每籠1只，連續(xù)喂養(yǎng)3 d(飼養(yǎng)方案同基礎(chǔ)飼料配方)。分別測量24只大鼠在第1～3天的24 h尿量、尿草酸濃度、尿肌酐濃度等指標(biāo)，并計算出用尿肌酐校正的24 h尿草酸總排泄量，此校正結(jié)果旨在排除飲水量對尿草酸的影響。校正公式為：24 h尿草酸總排泄量=(尿草酸濃度×24 h尿量)/24 h尿肌酐濃度。其中，尿草酸濃度用高效液相色譜法檢測，尿肌酐濃度用自動生化分析儀檢測。

統(tǒng)計學(xué)處理本研究屬于單因素重復(fù)測量設(shè)計，各組分別進(jìn)行自身前后對照，同時進(jìn)行組間對照。定量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS 17.0中一般線性模型的重復(fù)測量模塊進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行不同時間點兩兩比較。首先對重復(fù)測量數(shù)據(jù)在各時間點之間的關(guān)系是否滿足Huynh-Feldt條件進(jìn)行球形檢驗(χ2=54.711，Plt;0.001)，由于數(shù)據(jù)不符合Huynh-Feldt條件，表明數(shù)據(jù)間存在高度的相關(guān)性，故采用多變量方差分析。Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表 1 3組大鼠第1～3天飼料內(nèi)CaCO3的含量(mg/g)

結(jié) 果

主效應(yīng)與交互效應(yīng)分析24 h尿草酸總排泄量隨時間變化而變化(F=7.893,Plt;0.01)；時間因素與分組因素之間無交互作用(F=1.142,Pgt;0.05)；24 h尿草酸總排泄量隨分組變化而變化(F=3.565,Plt;0.05)。

24h尿草酸總排泄量3組大鼠第3天24 h尿草酸總排泄量均顯著高于第1天(Plt;0.05)(表2)。

討 論

目前國內(nèi)外對草酸鈣結(jié)石患者仍然普遍推薦限鈣飲食，國內(nèi)許多泌尿外科學(xué)與營養(yǎng)學(xué)專著推薦的限鈣飲食量甚至低至150 mg/d，還不到國家推薦每日攝鈣標(biāo)準(zhǔn)的1/5和歐美國家居民每日鈣平均攝入量的1/8。西方學(xué)者推薦限鈣飲食的理論基礎(chǔ)為：歐美國家居民飲食草酸攝入量較少，飲食鈣攝入量普遍較高，高鈣尿癥是其尿石癥的主要危險因素。而中國的情況截然相反。據(jù)調(diào)查，中國人平均日攝鈣量僅為405 mg，還不到中國營養(yǎng)學(xué)會飲食日推薦量標(biāo)準(zhǔn)(1988年)的一半[4-5]；中國人膳食中植食成分較多，草酸攝入量較高，其膳食結(jié)構(gòu)具有“低鈣高草酸”的特點?？梢姡瑬|西方人的飲食習(xí)慣、膳食結(jié)構(gòu)存在明顯差異，因而國外推薦的限鈣飲食方案未必適用于中國的草酸鈣結(jié)石患者。本研究擬通過建立大鼠“低攝鈣相關(guān)性高草酸尿癥”模型，圍繞飲食鈣對尿草酸水平的影響進(jìn)行初步探討。

本研究顯示，當(dāng)攝鈣量在各自區(qū)間內(nèi)隨時間不斷遞減時，3組大鼠的24 h尿草酸總排泄量均呈遞增趨勢，提示大鼠飲食鈣攝入水平和24 h尿草酸總排泄量密切相關(guān)，其尿草酸水平隨飲食鈣攝入量下降而呈上升趨勢。筆者將這種由飲食鈣攝入量降低引起的腸源性高草酸尿癥暫稱之為“低攝鈣相關(guān)性高草酸尿癥”。筆者認(rèn)為，這種“低攝鈣相關(guān)性高草酸尿癥”的內(nèi)在機(jī)制可能是：正常情況下，飲食鈣可與腸內(nèi)游離草酸形成不溶性草酸鈣經(jīng)糞便排出[6-7]，而當(dāng)給予低鈣飲食時，腸內(nèi)游離草酸增多，進(jìn)而增加了飲食草酸的經(jīng)腸吸收，最終增加了尿草酸的排泄量[8-9]。研究表明，高草酸尿是比高鈣尿更危險的成石因素，前者對草酸鈣過飽和的影響是后者的10倍[10]。顯然，長期低鈣飲食可能通過提高尿草酸排泄量，增加發(fā)生草酸鈣結(jié)石的危險性。

實驗中的大鼠飼料配方參考美國官方分析化學(xué)師協(xié)會的飼料配方標(biāo)準(zhǔn)[3]，并模仿中國人膳食結(jié)構(gòu)的“低鈣高草酸”特點，各組大鼠的飼料除飲食鈣外，其余組分配比(包括飲食草酸)完全相同，以此控制非實驗因素產(chǎn)生的誤差。實驗采用高效液相色譜法測定大鼠尿草酸濃度，草酸最低檢測限為0.4 μg/ml[11]，明顯提高了檢測靈敏度。在實驗設(shè)計方面采用了自身前后對照和組間對照相結(jié)合的方法，提高了實驗效率及可靠性。

綜上，通過控制大鼠飲食鈣攝入量，可以在大鼠體內(nèi)成功建立“低攝鈣相關(guān)性高草酸尿癥”模型。結(jié)合該實驗?zāi)Ｐ团c我國居民飲食鈣攝入的流行病學(xué)資料，筆者認(rèn)為，我國草酸鈣結(jié)石患者亦可能存在“低攝鈣相關(guān)性高草酸尿癥”，對此類患者如繼續(xù)推薦國外的限鈣飲食方案，將可能增加草酸鈣結(jié)石的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率，同時將增加低鈣相關(guān)性疾病(如甲狀旁腺功能亢進(jìn)、骨質(zhì)疏松癥，兒童佝僂病)的危險性。筆者設(shè)想，國內(nèi)草酸鈣結(jié)石患者不僅不應(yīng)推薦限鈣治療，反而應(yīng)提倡符合國家推薦標(biāo)準(zhǔn)的鈣飲食，這尚需進(jìn)一步的臨床研究證實。

表 2 3組大鼠24 h尿草酸總排泄量

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EstablishmentofARatModelofLowCalciumDietRelatedHyperoxaluria

TIAN Jing1, GUO Hong-qian2, SUN Xi-zhao2,SUN Ze-yu2, LU De-sheng1

1Emergency Center，2Department of Urinary Surgery，the Affiliated Drum Tower Hospital
of the Medical School of Nanjing University, Nanjing 210008，China

GUO Hong-qian Tel: 025-83304616-10702, E-mail:gulou-ghq@sina.com

ObjectiveTo establish a rat model of low calcium diet related hyperoxaluria and explore its features.MethodsBy means of randomized blocks design, totally 24 SD male rats were divided into low calcium diet group, medium calcium diet group, and high calcium diet group. Each group was sequentially fed on different calcium diets for 3 days. The urinary volume within 24 hours was recorded, the consistency of urinary oxalate by high-efficiency liquid chromatography, and the consistency of urine creatinine by automatic biochemical analyzer. The consistency was corrected to the output of urinary oxalate of rats in 24 hours, and the results were evaluated by repeated measurement of variance analysis and multivariate analysis of variance.ResultsThe output of urinary oxalate of rats in 24 hours varied with time (F=7.893,Plt;0.01). The time factors showed no association with the group division (F=1.142,Pgt;0.05). The output of urinary oxalate of rats in 24 hours varied with group division (F=3.565,Plt;0.05). The output of urinary oxalate in 24 hours in three groups on the third day was significantly higher than that on the first day (Plt;0.05).ConclusionBy controlling the calcium intake, we successfully established the model of low calcium diet related hyperoxaluria in rat.

calcium oxalate calculus；calcium diet；hyperoxaluria；hypercalciuria

郭宏騫 電話：025-83304616-10702，電子郵件：gulou-ghq@sina.com

R691.4；R696+.5

A

1000-503X(2012)02-0134-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.02.007

2011-06-27)