鹽酸阿比朵爾體外抑制2009新型流感病毒A(H1N1)的作用

張興權，代軍朋，蔡柏薔

1美國加州大學 圣地亞哥醫(yī)學院傳染病系, 拉霍亞，加州 92093 2石家莊四藥有限公司，石家莊 0521653中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院呼吸內科，北京 100730

·論著·

鹽酸阿比朵爾體外抑制2009新型流感病毒A(H1N1)的作用

張興權1，代軍朋2，蔡柏薔3

1美國加州大學 圣地亞哥醫(yī)學院傳染病系, 拉霍亞，加州 92093
2石家莊四藥有限公司，石家莊 052165
3中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院呼吸內科，北京 100730

目的檢測鹽酸阿比朵爾體外對2009新型流感病毒A(H1N1)復制的影響。方法采用2009新型流感病毒A(H1N1)感染MDCK細胞系統(tǒng)，檢測鹽酸阿比朵爾抗流感病毒的活性。血凝實驗、細胞病變保護實驗、RT-PCR 和定量RT-PCR實驗用于病毒滴度確定。使用Chou軟件系統(tǒng)計算藥物50%抑制病毒濃度和50%毒性濃度。結果鹽酸阿比朵爾在MDCK 細胞培養(yǎng)內顯示毒性低(50%毒性濃度gt;100 μmol/L)，且明顯抑制2009新型流感病毒A(H1N1)的復制。在血凝實驗、細胞病變保護實驗和定量RT-PCR檢測中， 鹽酸阿比朵爾50% 抑制病毒濃度分別為(5.5±0.9)、(3.4±0.8)和(1.5±0.2)μmol/L 。結論鹽酸阿比朵爾明顯抑制2009新型流感病毒A(H1N1)復制活性，而且具有誘生干擾素和免疫激活活性，作為一種抗流感病毒藥物，它是有價值的。

鹽酸阿比朵爾；2009新型流感病毒A(H1N1); RT-PCR

ActaAcadMedSin, 2012,34(2):126-129

目前，臨床使用的抗流感病毒藥物有4種，即金剛烷胺(amantadine)、金剛乙胺(remantadine)、扎那米韋(zanamivir) 和奧司他韋(oseltamivir)[1-2]。前兩種藥物最大的問題是因迅速產生耐藥病毒株而失去效果，因此在臨床上的應用有限。扎那米韋和奧司他韋是流感病毒神經氨酸酶抑制劑，對流感A、B和豬流感病毒均有明顯的抑制活性，其中口服的奧司他韋成為首選的一線藥物，但是目前已發(fā)現針對扎那米韋和奧司他韋的耐藥毒株。目前抗流感病毒藥物靶點窄、數量少、價格不菲，發(fā)展活性強、價格便宜和作用于病毒不同靶點的新藥勢在必行。鹽酸阿比朵爾(恩爾欣，arbidol) 系前蘇聯(lián)化學和制藥研究院研制的一種新型抗流感病毒藥物，目前已在少數國家臨床使用[3]。 文獻報道該藥明顯抑制季節(jié)性流感病毒復制，作用機制包括阻止病毒融合與復制、誘生干擾素、明顯提高自身免疫力[4-5]， 但對豬流感病毒的作用報道較少。本研究采用生物學和分子生物學技術探討鹽酸阿比朵爾對2009新型流感病毒A(H1N1)復制的影響。

材料和方法

材料MDCK 細胞系、CCL34細胞購自美國標準生物品收藏中心。培養(yǎng)基使用Eagle’s Minimal Essential 10%胎牛血清、1.0 mmol/L丙酮酸鈉, 0.1mmol/L MEM非必需氨基酸，1.5 g/L碳酸氫鈉，1%青霉素/鏈霉素。2009新型流感病毒A(H1N1)為美國加州圣地亞哥醫(yī)學院傳染病系提供。培養(yǎng)基為DMEM, 牛血清白蛋白2%, Herpes緩沖液25 mmol/L, TPCK-胰蛋白酶(Worthington 生物化學公司，Lakewood, NJ, USA)2 μg/ml。鹽酸阿比朵爾原料藥為石家莊四藥有限公司提供，奧司他韋由Hoffmann-La Roche公司提供。

藥物毒性測定2.5×106/ml MDCK 細胞懸液 200 μl 被種入96孔培養(yǎng)板內，37℃、5% CO2孵箱內培養(yǎng)24～48 h致細胞單層長成。藥物被連續(xù)4倍稀釋，最高濃度為100 μmol/L, 每個藥物濃度為3孔。細胞毒性測定使用MTS(試劑盒 購自Promega公司, Madison, WI, USA)法，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

藥物活性測定2.5×106/ml MDCK 細胞懸液 200 μl 被種入96孔培養(yǎng)板內，37℃ 、5% CO2孵箱內培養(yǎng)48 h致細胞單層長成。配制病毒懸液至100倍50%細胞感染的病毒量, 含有細胞單層的每孔加入50 μl 病毒懸液，之后在37℃、5% CO2孵箱內培養(yǎng)2 h。用病毒培養(yǎng)基洗細胞1次， 然后在培養(yǎng)板內加入4倍稀釋的藥物，最高藥物濃度為50 μmol/L。 培養(yǎng)72 h后鏡下觀察細胞病變程度，并收獲上清，用于血凝實驗、RT-PCR和 定量RT-PCR實驗。同時，觀察細胞病變(cytopathic effect, CPE)。奧司他韋作為陽性對照藥。

血凝實驗：準備1個V型底的96孔板，每孔內加入50 μl 收獲的上清液。隨后，50 μl 1% 豚鼠紅細胞加入每孔， 并輕輕混勻。室溫下放置 1 h。陰性結果是紅血球斑點集聚在孔中央，陽性結果是整個孔底形成均勻的紅色，病毒滴度是產生陽性反應的最高稀釋度值。

CPE：在病毒感染和藥物處理72 h后，鏡下觀察給藥和病毒對照組病毒對細胞產生的致病變作用。 lt;25% CPE為“+”,25%～50% CPE為“++”, 50%～75%為“+++”，gt;75%為“++++”。

RT-PCR：收獲培養(yǎng)3d的細胞上清液，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN Sciences，MD，USA)提取流感病毒RNA,具體實驗程序嚴格按照試劑盒說明書進行。被提取的病毒RNA儲存在-70℃待用。隨后, 一步法RT-PCR 核酸放大在PCR 儀(C1000 Peltier Thermal Cycler，BIO-RAD Laboratories, Inc, CA, USA)內進行。正義引物序列：5’-GTCCTATAAACACCAGCCTYCCA-3’；反義引物序列：5’-CGGGATATTCCTTAATCCTGTRGC-3’。反應條件：50℃，30 min，逆轉錄；95℃，15 min。 94℃，15 s； 55℃，15 s；72℃，30 s；共40個循環(huán)。 RT-PCR產物經 1% 瓊脂糖凝膠分析，2009新型流感病毒A(H1N1)血凝毒(hemagglutinin, HA)的大小為115 bp。

定量RT-PCR：病毒RNA 與RT-PCR實驗中使用的相同。 定量RT-PCR采用一步定量RT-PCR試劑盒(Superscript Ⅲ Platinum One Step Quantitative RT-PCR System，Invitrogen)。核酸放大在PCR 儀(Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-time PCR system，Life Technologies，CA, USA)內進行。引物：SWINFA-F-20: 5’-GCACGGTCAGCACTTATYCTRAG-3’；SWINFA-R-20：5’-GTGRGCTGGGTTTTCATTTGGTC-3’。探針: SWINFA-P-5FAM-CYACTGCAAGCCCA(T-BHQ1)AC- ACACAAGCAGGCA-SpacerC3。反應條件: 50℃，30 min；95℃，10 min。95℃，15 s變性；60℃ 1 min退火/伸展；共40個循環(huán)。

統(tǒng)計學處理50% 抑制濃度(inhibition concentration 50%, IC50)、50% 毒性濃度(cytotoxic concentration 50%, CC50)由 Chou Dose Effect Program 軟件計算決定[6]。

結 果

鹽酸阿比朵爾對2009新型流感病毒A(H1N1)的抑制活性鹽酸阿比朵爾對MDCK細胞毒性作用小，CC50gt;100 μmol/L。當病毒預先感染細胞2 h后加入系列稀釋的藥物，3 d 后檢測HA 滴度，計算ID50為(5.5±0.9) μmol/L。 若將藥物和病毒同時加入細胞培養(yǎng)，藥物的IC50為(5.1±1.2)μmol/L, 與病毒預先感染2 h差異無統(tǒng)計學意義。奧司他韋用于陽性對照，在病毒預先2 h感染細胞，ID50為(0.15±0.03) μmol/L。

在病毒預先感染細胞2 h后加入藥物，3 d后顯微鏡下觀察CPE，細胞對照組為發(fā)現病變，病毒對照組病變?yōu)椤?+++”，當藥物濃度依次為50、25、12.5、6.25 和3.125 μmol/L時，CPE 順序為 “-”, “+”，“++”， “++”, “+++” (圖1)。計算 IC50為(3.4±0.8)μmol/L。

A-E.鹽酸阿比朵爾系列濃度為50, 25, 12.5, 6.25,3.125 μmol/L; F.病毒對照；G.細胞對照A-E.arbidol concentrations 50, 25, 12.5, 6.25,3.125 μmol/L; F.virus control; G.cell control圖1 鹽酸阿比朵爾對流感病毒致細胞病變的保護作用Fig 1 Protection of arbidol against cytopathic effect caused by influenza virus infection in MDCK cells

1-5：鹽酸阿比朵爾濃度分別為 25、12.5、6.25、3.125和1.5625 μmol/L；6：病毒對照1-5：arbidor concentrations are 25, 12.5, 6.25, 3.125, and 1.5625 μmol/L respectively;6: virus control圖2 RT-PCR方法檢測鹽酸阿比朵爾對流感病毒復制的抑制作用Fig 2 Inhibitory effect of arbidol on influenza virus replication (RT-PCR)

鹽酸阿比朵爾對病毒核酸復制的影響在加入藥物 3 d 后, RT-PCR 實驗結果顯示：25 μmol/L的鹽酸阿比朵爾明顯抑制病毒核酸產生，2009新型流感病毒A(H1N1)具有HA特異的115 bp帶缺失；與病毒對照相比，12.5、6.25和3.125 μmol/L鹽酸阿比朵爾也在一定程度上減少病毒核酸的復制(圖2)。在定量RT-PCR實驗中，未使用藥物的病毒對照組病毒RNA 拷貝數 (×106)為 4.66±0.59;當藥物濃度依次為25、12.5、 6.25 、3.125、1.5625和0.7813 μmol/L時，病毒 RNA 拷貝數分別為 0.25±0.11、0.18±0.08、0.67±0.38、2.56±0.83、2.03±0.48和2.33±0.48(圖3)。計算 IC50為(1.5±0.2)μmol/L。

圖3 定量RT-PCR方法檢測鹽酸阿比朵爾對流感病毒復制的抑制作用Fig 3 Inhibition of arbidol hydrochloride against influenza virus replication, as shown by quantitative RT-PCR

討 論

在過去的100多年內，人流感病毒曾造成全球4次大流行，它們分別是1918年西班牙流感(A，H1N1)、1957年亞洲流感(A，H2N2)、1968年香港流感(A，H3N2) 和2009新型流感病毒A(H1N1)，亦稱豬流感病毒(swine flu virus) 感染[7]。2009新型流感病毒A(H1N1)流行已造成全球近萬人死亡，前3次流感大流行分別造成成百萬到上千萬人死亡，即使未發(fā)生流感大流行的年代，全世界每年也有25萬人死于流感并發(fā)癥[7-8]，因此防治流感及其并發(fā)癥的研究成為保障人類健康的重要課題。雖然流感病毒疫苗能有效地減輕感染的流行，但是流感病毒的抗原漂移和基因重組阻礙了疫苗的使用和效果，因此抗流感病毒的化療藥物在防治流感上發(fā)揮著重要的作用。

由于抗流感病毒化療藥物金剛烷胺和金剛乙胺臨床使用后迅速產生耐藥病毒株，致使其逐漸淡出第一線選擇的臨床藥物。扎那米韋和奧司他韋雖然具有較強的抑制流感病毒能力，但是逐漸顯現出的耐藥病毒株也給其臨床應用帶來隱患[9]。此外，這兩種藥物價格較貴，致使在臨床上不能廣泛使用，尤其在發(fā)展中國家。更嚴峻的問題是抗流感病毒感染的藥物種類太少，所針對的病毒靶點窄，這給聯(lián)合用藥和替換用藥帶來困難。 針對上述問題的種種舉措正在深入發(fā)展中， 如為了控制豬流感病毒的流行，美國食品及藥物管理局特例批準可用尚未上市的帕拉米韋(peramivir) 治療對奧司他韋耐藥的流感患者[10]。另外，一些作用于其他靶點的如針對病毒HA 蛋白、病毒RNA 聚合酶蛋白以及病毒神經氨酸酶的新藥正在研制當中[11]。

鹽酸阿比朵爾是從俄國引進的一種抗流感病毒感染的藥物。與奧司他韋不同，該藥不是病毒神經氨酸酶抑制劑，它在細胞培養(yǎng)中對季節(jié)性流感病毒IC50在10～20 μmol/L, CC50在100 μmol/L左右[4-5]。本研究結果顯示鹽酸阿比朵爾在體外細胞培養(yǎng)實驗中對2009新型流感病毒A(H1N1)復制也具有抑制活性。IC50分別為5.5 (HA測定)、3.4 (CPE實驗)和1.5 μmol/L (定量RT-PCR)。本研究還確定鹽酸阿比朵爾對MDCK 細胞的毒性，TC50gt;100 μmol/L。盡管鹽酸阿比朵爾抑制流感病毒活性較低于奧司他韋，但鹽酸阿比朵爾還有誘生干擾素和活化巨噬細胞作用， 且該藥作用于病毒HA新靶點，價格稍便宜，因此鹽酸阿比朵爾是有廣泛應用前途和有價值的抗流感病毒藥物。

為了讓更多的國家和地區(qū)接受鹽酸阿比朵爾，一些深入的研究應該進行，包括鹽酸阿比朵爾與已知臨床藥物的協(xié)同作用研究、鹽酸阿比朵爾對奧司他韋等耐藥株的作用。此外，鹽酸阿比朵爾的作用機制應更準確地揭示和闡明。

綜上，鹽酸阿比朵爾在細胞培養(yǎng)中明顯抑制季節(jié)性流感病毒和2009新型流感病毒A(H1N1)的復制，且毒性較低，加之考慮到該藥有誘生干擾素和免疫激活作用，價格低于奧司他韋， 因此認為鹽酸阿比朵爾是有價值的抗流感病毒感染的藥物。

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Thein-vitroEffectsofArbidolHydrochlorideAgainst2009NewInfluenzaVirusA(H1N1)

ZHANG Xing-quan1，DAI Jun-peng2，CAI Bai-qiang3

1Infectious Disease Division, Medical School, University of California, San Diego L Jolla CA 92093，USA
2Shijiazhuang No.4 Pharmaceutical Co. Ltd，Shijiazhuang 052165, China
3Department of Pulmonary Medicine,PUMC Hospital,CAMS and PUMC, Beijing 100730, China

Corresponding auther: CAI Bai-qiang Tel: 010-69155039, FAX: 010-65231169,E-mail: caibq2009@hotmail.com

ObjectiveTo detect thein-vitroeffects of arbidol hydrochloride against 2009 new influenza virus A (H1N1).MethodsThe activity of arbidol hydrochloride against 2009 new influenza virus A (H1N1) was determined in MDCK cell cultures. Hemagglutination assay, observation of cytopathic effects, RT-PCR and quantitative RT-PCR tests were performed for determination of virus titers. Inhibition concentration 50% and cytotoxic concentration 50% were calculated with Chou’s Menu of Dose-Effect Program.ResultsArbidol hydrochloride showed low cytotoxicity (cytotoxic concentration 50%gt;100 μmol/L)and significant anti-2009 new influenza virus A (H1N1) activity in cell cultures. Inhibition concentration 50% were (5.5±0.9), (3.4±0.8), and (1.5±0.2) μmol/L in hemagglutination assay, cytopathic effect test, and quantitative RT-PCR assay, respectively.ConclusionArbidol has low cytotoxicity and high anti-virus activity and can effectively trigger the activities of interferon and immune response, and therefore can be a valuable anti-influenza virus drug.

arbidol hydrochloride; 2009 new influenza virus A (H1N1); RT-PCR

蔡柏薔 電話：010-69155039，傳真：010-65231169,電子郵件：caibq2009@hotmail.com

R 978.7； R373.1+3

A

1000-503X(2012)02-0126-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.02.005

2011-05-26)