應(yīng)用激流式生物反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)昆蟲細胞(sf9)的工藝研究

趙立民 蔣天華 羅乃杰 （廣東溫氏食品集團有限公司研究院 廣東 新興 527400）

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應(yīng)用激流式生物反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)昆蟲細胞(sf9)的工藝研究

趙立民 蔣天華 羅乃杰 （廣東溫氏食品集團有限公司研究院 廣東 新興 527400）

應(yīng)用激流式生物反應(yīng)器對大規(guī)模懸浮培養(yǎng)sf 9細胞的工藝進行了研究，通過摸索細胞接種密度、溶解氧(DO)、反應(yīng)器轉(zhuǎn)速3項工藝參數(shù)，成功實現(xiàn)了sf 9細胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，細胞密度最高可達到0.8~1.5×106/ml，生長狀態(tài)良好。

激流式生物反應(yīng)器 sf 9細胞 接種密度 DO 轉(zhuǎn)速

sf 9細胞由G.E. Smith和C.L. Cherry在1983年從細胞株IPLB-SF 21 AE得來的一個克隆，是目前國際上常用的細胞株之一，可作為豬圓環(huán)病毒(PCV)等多種病毒的宿主細胞，用于生產(chǎn)獸用疫苗，也可用于昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統(tǒng)，制備各種農(nóng)業(yè)殺蟲劑等，用途廣泛[1]。相比哺乳動物細胞，昆蟲細胞對生長環(huán)境要求苛刻，所需培養(yǎng)液營養(yǎng)豐富，添加的血清須是高質(zhì)量的胎牛血清[2]。細胞本身嬌弱，對剪切力敏感，較難以反應(yīng)器發(fā)酵的方式進行大規(guī)模培養(yǎng)。激流式生物反應(yīng)器是目前國內(nèi)新興的一次性生物反應(yīng)器，具有剪切力小、控制精準(zhǔn)、操作簡單、規(guī)模易放大等特點。本文采用該反應(yīng)器，通過對相關(guān)工藝參數(shù)的摸索，進行了sf 9細胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)工藝的實驗研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 sf 9昆蟲細胞，購自武漢生物所，100~150代。

1.1.2 細胞培養(yǎng)液 Grace干粉培養(yǎng)基(Gibco)，每升添加0.35gNaHCO3、1.3g水解乳蛋白、3g酵母提取物，用Millipore超純水溶解，稀HCl調(diào)節(jié)pH至6.2后，0.22mm濾芯除菌過濾；使用時添加10%熱滅活胎牛血清(Hyclone)。

1.1.3 檢測試劑 葡萄糖檢測試劑盒(南京建成)

1.1.4 主要設(shè)備 激流式生物反應(yīng)器(AP20型，杭州安普生物工程有限公司)，細胞計數(shù)儀(Count Start)，紫外分光光度計(國產(chǎn)美譜達)。

1.1.5 其他 壓縮空氣、CO2。

1.2 方法

激流式反應(yīng)器可以通過自動控制方式調(diào)節(jié)各項培養(yǎng)參數(shù)，讓細胞的生長環(huán)境始終處于一種穩(wěn)定狀態(tài)，與平板靜態(tài)培養(yǎng)的主要區(qū)別在于反應(yīng)器轉(zhuǎn)速、DO、接種密度等的不同。sf 9細胞的平板培養(yǎng)工藝較為成熟，其確定的某些常規(guī)參數(shù)可直接應(yīng)用于反應(yīng)器，如培養(yǎng)溫度28℃，pH6.2[3]?，F(xiàn)在需要摸索分析的是接種密度、反應(yīng)器轉(zhuǎn)速、DO3項工藝參數(shù)。

反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)sf 9細胞的主要流程為：調(diào)好反應(yīng)器的各項參數(shù)，將搖瓶中處于對數(shù)生長期，狀態(tài)良好的sf 9細胞應(yīng)用細胞計數(shù)儀計數(shù)，計算接種量后，無菌接種至反應(yīng)器內(nèi)，初始培養(yǎng)體積為1L。細胞接種后每隔24h取樣1次，進行細胞計數(shù)，觀察細胞狀態(tài)，測定葡萄糖含量，并根據(jù)樣品的檢測結(jié)果補加新鮮培養(yǎng)基，直至總培養(yǎng)體積5L為止。

1.2.1 細胞接種密度梯度試驗 將細胞接種密度分為低密度(0.2×105cells/ml)、中密度(1.0×105cells/ml)、高密度(5.0×105cells/ml)三個梯度，其他工藝參數(shù)設(shè)置為培養(yǎng)溫度28℃，pH6.2，轉(zhuǎn)速40rpm，DO60%，進行sf 9細胞的反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)，觀察在不同細胞接種密度情況下的細胞生長情況。

1.2.2 轉(zhuǎn)速梯度實驗 將轉(zhuǎn)速分為低轉(zhuǎn)速(30rpm)、中轉(zhuǎn)速(50rpm)、高轉(zhuǎn)速(80rpm)三個梯度，其他工藝參數(shù)設(shè)置為培養(yǎng)溫度28℃，pH6.2，DO50%，細胞接種密度1.0× 105cells/ml，進行sf 9細胞的反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)，觀察在設(shè)置不同轉(zhuǎn)速情況下的細胞生長情況。

1.2.3 DO梯度實驗 將DO分為低DO(30%)、中DO (60%)、高DO(90%)三個梯度，其他工藝參數(shù)設(shè)置為培養(yǎng)溫度28℃，pH6.2，轉(zhuǎn)速50rpm，細胞接種密度1.0×105cells/ml，進行sf 9細胞的反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)，觀察在設(shè)置不同DO情況下的細胞生長情況。

2 結(jié)果

2.1 細胞接種密度梯度 如圖1，在低密度接種情況下，細胞生長緩慢，尤其在細胞生長前期。在高密度接種情況下，生長前期增殖迅速，但隨后生長速度趨緩。在中密度接種情況下，細胞也能較快的進入對數(shù)生長期，而且曲線平穩(wěn)，在生長后期甚至可超過高密度接種，細胞狀態(tài)良好?？紤]到細胞種準(zhǔn)備工作等因素，確定中密度接種參數(shù)較優(yōu)。

2.2 反應(yīng)器轉(zhuǎn)速梯度 如圖2，在低轉(zhuǎn)速條件下，整個培養(yǎng)流程中細胞生長數(shù)量均低于其他兩種方式，后期取樣鏡檢有較多細胞粘連現(xiàn)象。在高轉(zhuǎn)速條件下，細胞前期生長情況正常，但是中后期的生長速度明顯低于中轉(zhuǎn)速，并且取樣的培養(yǎng)液中細胞碎片較多。中轉(zhuǎn)速條件下細胞生長速度正常，鏡檢狀態(tài)良好，確定中轉(zhuǎn)速參數(shù)較優(yōu)。

2.3 DO梯度 如圖3，在3種梯度DO的條件下，細胞生長情況正常，曲線走向基本一致，無明顯的變化。

圖1

圖2

圖3

(注：上述3圖中，縱軸表示反應(yīng)器內(nèi)的細胞總量，單位(×108 cells)，橫軸為培養(yǎng)天數(shù)，單位d)

3 討論

3.1 密度與生長關(guān)系 細胞有群體生長優(yōu)勢的特點，不斷分泌有益于本身的物質(zhì)，如促生長因子等，營造對本身生長的有利環(huán)境。所以，細胞接種密度的高低，將直接影響進入對數(shù)生長期的時間。有文獻報道，sf 9細胞的平板接種密度若低于104cells /ml，細胞甚至不會正常生長[3]。細胞在分泌有益物質(zhì)的同時，還會排泄有害的代謝產(chǎn)物，如氨、乳酸等[4]。這些代謝產(chǎn)物的不斷積累，對細胞的生長會產(chǎn)生消極影響。所以細胞高密度接種的最終效果不一定能夠達到最優(yōu)。

3.2 轉(zhuǎn)速與細胞增殖 激流式生物反應(yīng)器沒有攪拌槳，運行時以整體搖動的方式帶動其內(nèi)部的培養(yǎng)液搖動，從而達到混和、溶氧的效果。該種混合方式剪切力相應(yīng)降低，溶氧效率更高。Sf 9細胞的個體體積較大，本身脆弱，易受剪切力的影響。從圖3中可以看出，在高轉(zhuǎn)速條件下，早期由于細胞密度較低，高轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的高剪切力只對少量的細胞產(chǎn)生不利影響，細胞生長尚正常，但隨著細胞的不斷增殖，高剪切力的破壞力也越大。另外高轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的培養(yǎng)液泡沫更多，其破裂產(chǎn)生的表面張力對細胞也有很大的破壞力。在兩方面作用下，部分細胞死亡，分裂后的細胞碎片又對正在生長的細胞產(chǎn)生不利影響，如此反復(fù)循環(huán)，導(dǎo)致培養(yǎng)后期的活細胞密度反而不高，培養(yǎng)液中雜質(zhì)增多。在低轉(zhuǎn)速時，剪切力雖然更低，但由于低轉(zhuǎn)速的混合效果不好，營養(yǎng)難以均一，溶氧不充分，細胞生長狀況并不理想。同時低轉(zhuǎn)速也令細胞的分散度降低，細胞結(jié)團的現(xiàn)象增多。中轉(zhuǎn)速則兼顧了混合均一與低剪切力的優(yōu)勢，同時滿足了溶氧要求，保證細胞的正?？焖僭鲋?。

3.3 DO梯度與細胞形態(tài) Sf 9對溶解氧濃度的要求方面與哺乳動物細胞相似，只要保證其最低溶解氧濃度，即可進行正常的生長代謝活動，即使將DO提升至90%，對細胞的增值時間并沒有產(chǎn)生顯著影響。在實驗中我們也發(fā)現(xiàn)，根據(jù)細胞密度的不同，細胞培養(yǎng)所需的最低DO也會不同。細胞密度越高，所需的最低DO也將相應(yīng)上升。如果低于所需的最低DO，生長速度將很快下降，甚至停止。由于沒有做高DO對sf 9細胞生理代謝方面影響的實試驗，根據(jù)以往其他細胞大規(guī)模培養(yǎng)的經(jīng)驗，可將反應(yīng)器培養(yǎng)sf 9細胞的DO設(shè)定在50%~60%。

本試驗中，作為反應(yīng)器供氧的來源，只需要壓縮空氣即可滿足sf 9細胞的耗氧要求。但要培養(yǎng)同樣規(guī)模的其他懸浮細胞，如BHK-21、HEK293等，在培養(yǎng)中后期則必須通入純氧氣方能保證DO的穩(wěn)定。由此可見，相比其它哺乳動物細胞，應(yīng)用反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)sf 9細胞的耗氧量并不突出。從設(shè)定的參數(shù)來看，本梯度試驗中的參數(shù)設(shè)定最接近優(yōu)化后的組合，從圖3看細胞生長曲線，在第2天進入對數(shù)生長期，平均倍增時間約22~26h，細胞接種后5~6d。細胞密度即可達到峰值1.0~1.5×106cells /ml(總體積5L)，細胞狀態(tài)良好，與所接細胞種的形態(tài)基本無差別。

本試驗過程中，細胞培養(yǎng)液的pH表現(xiàn)的非常穩(wěn)定，即使在細胞培養(yǎng)后期，也極少補加NaHCO3進行調(diào)節(jié)，這可能與sf 9細胞在代謝過程中利用乳酸有關(guān)[5]。

4 結(jié)論

本文中對應(yīng)用激流式生物反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)sf 9細胞的幾項關(guān)鍵工藝參數(shù)進行了初步研究，確定優(yōu)化后的工藝參數(shù)為培養(yǎng)溫度28℃，pH6.2，轉(zhuǎn)速50rpm，細胞接種密度1.0×105cells/ml，DO50%，并通過相關(guān)試驗證明了上述參數(shù)的可行性。上述參數(shù)可通過相似的試驗再次優(yōu)化，以期得到最佳效果。同時，該結(jié)果也可以作為進一步規(guī)模放大的依據(jù)。

[1] lain R.Cameron Trendsin Biotechnology. 1989.7: 66-70.

[2] 金小紅, 孟哲峰, 陳存國. 小牛血清和胎牛血清對Sf 9細胞生長和重組蛋白表達影響的比較[J]. 中國病理生理雜志, 2006(2).

[3] 王曉遲, 戚藝華, 歐陽帆. Sf 9細胞的培養(yǎng)工藝[J]. 化工冶金, 1998, 19(4): 277-280.

[4] 趙佼, 譚文松, 周燕等. 昆蟲細胞(Sf21)懸浮培養(yǎng)過程中生長限制性基質(zhì)間歇補加技術(shù)的應(yīng)用[J]. 生物工程學(xué)報, 2000, 16(3): 357-362.

[5] 徐殿勝, 陳國豪, 陸兵等. 昆蟲細胞(Sf 9)培養(yǎng)中葡萄糖、乳酸的影響[J]. 生物工程學(xué)報, 1996, 12(4): 508-511.

（2012–06–29）

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