蜂蜜中鏈霉素多種檢測(cè)方法比較

趙曉鳳 （新疆獸藥飼料監(jiān)察所 烏魯木齊 830000） 何方洋 汪善良 張禹 李勇 田甜 陳連星 （北京勤邦生物技術(shù)有限公司）

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蜂蜜中鏈霉素多種檢測(cè)方法比較

趙曉鳳 （新疆獸藥飼料監(jiān)察所 烏魯木齊 830000） 何方洋*汪善良 張禹 李勇 田甜 陳連星 （北京勤邦生物技術(shù)有限公司）

采用膠體金免疫層析法、酶聯(lián)免疫法與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法三種常用分析方法對(duì)蜂蜜中殘留的鏈霉素進(jìn)行檢測(cè)，考察了三種方法的符合率。結(jié)果表明，膠體金免疫層析法具有操作簡(jiǎn)便、快速、直觀的特點(diǎn)，酶聯(lián)免疫法靈敏度高適合作為快速篩選方法，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可進(jìn)行陽性樣品的確證和精確定量。

鏈霉素 膠體金免疫層析法 酶聯(lián)免疫法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 蜂蜜

鏈霉素(Streptomycin, SM)是一種常見的氨基糖苷類抗生素，是目前我國畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)中的常用藥物之一。但其耐藥性強(qiáng)，毒副作用較大，若動(dòng)物性食品中有過量的鏈霉素殘留，則可能對(duì)人造成嚴(yán)重危害。為了保障動(dòng)物源性食品的安全，歐盟2377/90/EEC(703/2007修訂) 規(guī)定動(dòng)物性食品肌肉、脂肪、肝臟中鏈霉素最大殘留限量(MRLs)為500μg/kg，腎臟中為1000μg/kg，奶中為200μg/kg[1]。我國農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定鏈霉素在牛奶中殘留限量為200μg/L，在肌肉、脂肪、肝中為600μg/kg，在腎中為1000μg/kg。

目前鏈霉素殘留的檢測(cè)方法主要包括微生物法、免疫學(xué)法、液相色譜法、質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法等[2-12]。如化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)水產(chǎn)品中鏈霉素檢出限為0.05μg/g[4]；高效液相色譜柱后衍生物法測(cè)定蜂王漿中的鏈霉素檢出限0.005mg/kg[5]；雙柱固相萃取凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定牛奶和奶粉中鏈霉素和雙氫鏈霉素，牛奶檢出限為4μg/kg，奶粉檢出限為30μg/kg[6]；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定奶粉中鏈霉素與雙氫鏈霉素，檢出限為0.01mg/kg[7]；HPLC-MS/MS測(cè)定蜂蜜中鏈霉素和雙氫鏈霉素，鏈霉素檢出限0.002mg/kg，雙氫鏈霉素0.001mg/kg[8]；提取凈化及液相色譜檢測(cè)方法檢測(cè)蜂王漿中鏈霉素檢出限為10μg/kg[9]；親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中的鏈霉素和雙氫鏈霉素，最低定量限分別為0.5μg/kg和1.0μg/kg[10]；以HPLC為代表的色譜技術(shù)已被證明為最有效的確證性檢測(cè)食品中農(nóng)獸藥殘留的手段之一。但由于儀器較昂貴、費(fèi)用高，不適合進(jìn)行大規(guī)?，F(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，而免疫學(xué)方法具有靈敏度高、成本低、大規(guī)模檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)研制出鏈霉素殘留快速檢測(cè)試紙，檢測(cè)限為8μg/L[11]。采用ELISA法檢測(cè)牛奶中鏈霉素殘留量檢測(cè)限可達(dá)20μg/L或以下，符合快速篩選方法的要求[12]。免疫測(cè)定方法的建立是未來抗生素殘留檢測(cè)的主要研究方向，而多方面技術(shù)的結(jié)合與應(yīng)用將是主要的研究手段[3]。

本文采用膠體金免疫層析法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法三種方法對(duì)蜂蜜中鏈霉素的檢測(cè)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明這三種方法具有很好的符合率，能滿足不同的檢測(cè)要求。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司生產(chǎn)；磷酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、中性氧化鋁分析純、庚烷磺酸鈉、甲酸、甲醇、乙腈色譜純、鏈霉素快速檢測(cè)試紙條、鏈霉素ELISA檢測(cè)試劑盒均由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供。

KS-Ⅱ振蕩器，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；DSY-Ⅲ氮吹儀，北京金科精華苑科技有限公司；QL-901漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Anke GL-20G-Ⅱ高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器有限公司；2000SBL電子天平，美國Setra公司；MK3酶標(biāo)儀和微量移液器(單道20~200μl、100~1000μl，多道50~ 300μl)，美國Thermo公司；Acquity液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源)及Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國Waters公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 膠體金免疫層析法 （1）樣品前處理：準(zhǔn)確稱取0.5g蜂蜜到4ml離心管中，加入樣本提取液1.5ml，渦動(dòng)1min，混勻待檢。（2）檢測(cè)方法：吸取100μl待檢樣本溶液于微孔中，緩慢抽吸使其充分與微孔中試劑混勻。將標(biāo)記好的試紙條插入微孔中，印有“MAX”線端朝下，使之充分浸入溶液中。室溫(20~25℃)孵育5min后，取出試紙條，根據(jù)示意圖判定結(jié)果。（3）檢測(cè)結(jié)果分析：當(dāng)樣品為陰性(－)時(shí)，檢測(cè)線(T線)顯色強(qiáng)于質(zhì)控線(C線)顯色或與C線顯色無明顯差異，表示蜂蜜樣本中不含有鏈霉素或其濃度低于檢測(cè)限。當(dāng)樣品為陽性(+)時(shí)，T線顯色明顯弱于C線顯色或T線不顯色，表示蜂蜜樣本中鏈霉素濃度等于或高于檢測(cè)限。當(dāng)C線不顯色時(shí)，表明不正確的操作過程或試紙條已失效。

1.2.2 酶聯(lián)免疫法 （1）樣品前處理：方法一：稱取1.0g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入10ml提取緩沖液(參見產(chǎn)品說明書)，用振蕩器振蕩10min至蜂蜜全部溶解，4000r/min室溫(20~25℃/68~77℉)離心10min，直至清亮。用RIDA C18柱(純化提取物)，用2ml甲醇洗柱子，流速為60滴/min；用2ml去離子水洗柱子，流速為60滴/min；取2ml樣本以流速為15滴/min過柱；用3ml去離子水洗柱子，45滴/min；用空氣吹干柱子；除去柱中水分，用1ml甲醇洗脫樣本，流速為15滴/min；在40~50℃水浴氮?dú)饬飨峦耆舭l(fā)溶劑；用2ml提取工作液(參見說明書)溶解干燥的殘留物；取50μl進(jìn)行分析。方法二：稱取1.0g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml 提取工作液，用振蕩器振蕩10min至蜂蜜全部溶解，4000r/min室溫(20~ 25℃/68~77℉)離心10min，直至清亮；取200μl清亮上清液，加入600μl提取工作液中混勻；取50μl進(jìn)行分析。（2）檢測(cè)方法：按照北京勤邦生物技術(shù)有限公司鏈霉素ELISA檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。（3）檢測(cè)結(jié)果分析：標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%。以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中鏈霉素實(shí)際殘留量。

1.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 稱取鏈霉素配制成100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再用空白樣品溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成0μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備 參考“GB/T 22995-2008 蜂蜜中鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那霉素殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法”標(biāo)準(zhǔn)方法中的7.1步驟進(jìn)行蜂蜜樣品制備。

1.3.3 色譜及質(zhì)譜條件 （1）色譜條件：Acquity UPLC?BEH C18柱(2.1×100mm，粒徑1.7μm)；柱溫為30℃；流動(dòng)相為A相：0.1%七氟丁酸，B相：乙腈；流速0.2ml/min；進(jìn)樣量5μl。流動(dòng)相及梯度洗脫條件見表1。（2）質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源；掃描方式為正離子掃描；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電離電壓0.5KV；離子源溫度150℃；脫溶劑溫度 350℃；碰撞氣流速 0.15ml/min；錐孔氣流速50L/hr；脫溶劑氣流速550L/hr。（3）檢測(cè)結(jié)果分析：采用外標(biāo)法對(duì)樣品中殘留的鏈霉素進(jìn)行定量分析。以鏈霉素藥物標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)豐度為縱坐標(biāo)，以不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品中相對(duì)豐度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出對(duì)應(yīng)的鏈霉素藥物的濃度，即為樣品中鏈霉素藥物實(shí)際殘留量。

表1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件 （min，%）

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.1.1 酶聯(lián)免疫法標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別測(cè)定鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0ng/L、50ng/L、150ng/L、450ng/L、1350ng/L、4050ng/L的吸光度，建立鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，IC50值為152.0ng/L。

圖1 鏈霉素ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 LC-MS/MS法標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別取鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L，經(jīng)LC-MS/MS法分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=27.31x +0.698，R2=0.998。

圖2 鏈霉素LC-MS/MS標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 檢測(cè)限

2.2.1 膠體金試紙條檢測(cè)限 在空白蜂蜜樣品中分別添加鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為：10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg；取試紙條進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)濃度測(cè)定5個(gè)重復(fù)，驗(yàn)證試紙條的最低檢測(cè)限。檢測(cè)結(jié)果顯示：在蜂蜜樣品中添加鏈霉素至終濃度為10μg/kg時(shí)試紙條檢測(cè)結(jié)果均顯示陰性，當(dāng)蜂蜜樣品中添加鏈霉素至終濃度為20μg/kg、40μg/kg時(shí)試紙條檢測(cè)結(jié)果均顯示陽性；可判讀鏈霉素膠體金試紙條在蜂蜜樣品中的檢測(cè)限為20μg/kg。

2.2.3 液相色譜及串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)限 最低檢測(cè)限按照定量離子信噪比3:1計(jì)算，得該方法在蜂蜜樣品中檢測(cè)限為5.0μg/kg。

2.3 三種方法檢測(cè)實(shí)際樣品結(jié)果比較

運(yùn)用三種方法對(duì)20份蜂蜜樣品進(jìn)行檢測(cè)，三種方法測(cè)定的結(jié)果基本一致。其中檢測(cè)出一份陽性樣本，ELISA檢測(cè)結(jié)果為310.8μg/kg，LC-MS/MS法檢測(cè)結(jié)果為301.9 μg/kg，鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量色譜圖如圖3，檢測(cè)出的陽性樣品質(zhì)量色譜圖如圖4。

圖3 鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品(50μg/L)質(zhì)量色譜圖

圖4 陽性樣品質(zhì)量色譜圖

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用三種方法對(duì)蜂蜜中殘留的鏈霉素進(jìn)行了檢測(cè)，如果蜂蜜樣品中有結(jié)晶，需要置于不高于60℃水浴中溫?zé)?，待蜂蜜全部融化后攪拌均勻，冷卻至室溫后進(jìn)行檢測(cè)。在ELISA檢測(cè)的洗滌過程中，要用吸水紙拍干以保證完全除去微孔中的液體，從而避免影響后續(xù)測(cè)試。

采用三種方法對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示基本一致。膠體金試紙條是一種基于免疫反應(yīng)的快速檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)便(不需要，或只進(jìn)行簡(jiǎn)單的前處理，操作簡(jiǎn)單易掌握)、快速，性能穩(wěn)定，重復(fù)性好，適合于進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)樣品的快速篩選，但由于其通過肉眼判斷顏色色度進(jìn)行結(jié)果判斷，不能測(cè)定藥物的準(zhǔn)確含量故只能用于定性粗篩。酶聯(lián)免疫試劑盒重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，比試紙條靈敏度高，也適合作為快速篩選方法。LC-MS/MS方法是實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)方法之一，具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性，可以對(duì)樣品進(jìn)行確證和精確定量，但由于對(duì)樣品前處理要求較高，需要先進(jìn)的分析儀器，成本也較高。因此在實(shí)際檢測(cè)中可以選擇膠體金試紙條等快速檢測(cè)方法作為對(duì)樣品的快速初篩方法，再將篩查的陽性樣品采用儀器方法進(jìn)行確證和精確定量。

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（2012–06–16）

S859.79+6

A

1007-1733(2012)08-0001-04