大花蕙蘭無菌播種與組培快繁技術(shù)研究

李茂娟， 譚柏韜， 鄧少華， 王華龍

(郴州市林業(yè)科學(xué)研究所， 湖南 郴州 423000)

大花蕙蘭無菌播種與組培快繁技術(shù)研究

李茂娟， 譚柏韜， 鄧少華， 王華龍

(郴州市林業(yè)科學(xué)研究所， 湖南 郴州 423000)

對(duì)大花蕙蘭的無菌播種及組培快繁技術(shù)進(jìn)行了相關(guān)研究。結(jié)果表明：大花蕙蘭無菌播種采用0.1%升汞溶液滅菌10min能取得較好的效果；改良MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L培養(yǎng)基對(duì)假鱗莖誘導(dǎo)原球莖效果較好，其原球莖誘導(dǎo)率可達(dá)86%；原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基為改良MS+NAA0.5mg/L,此配方對(duì)大花蕙蘭的壯苗生根同樣合適；采用固、液培養(yǎng)基交替培養(yǎng)(振蕩轉(zhuǎn)數(shù)100～110r/min)能有效地促進(jìn)原球莖增殖；移栽基質(zhì)配比為腐殖土∶棉籽殼=1∶1時(shí)，移栽苗成活率可達(dá)95%。

大花蕙蘭； 無菌播種； 組培快繁； 原球莖； 交替培養(yǎng)

大花蕙蘭(Cymbidiumgrandiflorium)是蘭科蘭屬中的一部分大花附生種類及其雜交種，是世界上栽培最普及的洋蘭之一，具有雍容華貴的外貌和色彩鮮艷的花朵，享有“蘭花皇后”的美譽(yù)，深受蘭花愛好者的歡迎，具有較大的市場(chǎng)潛力[1]。大花蕙蘭種子眾多而小，且多數(shù)發(fā)育不完全，常規(guī)播種難以萌發(fā)。傳統(tǒng)繁殖方式是分株繁殖，但繁殖系數(shù)低且容易引起退化。因此，研究大花蕙蘭組培快繁技術(shù)，對(duì)于解決市場(chǎng)需求，實(shí)現(xiàn)大花蕙蘭的規(guī)?；a(chǎn)具有重大意義[2]。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

大花蕙蘭供試種子和供試植株均來源于郴州市林業(yè)科學(xué)研究所花卉中心苗圃。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌播種誘導(dǎo)原球莖 取大花蕙蘭蒴果沖洗干凈后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%酒精浸泡30s，然后分別用2%次氯酸鈉，10%過氧化氫，0.1%升汞溶液處理[3]，處理時(shí)間分別為8、10、12min，接著用無菌水沖洗6～8次，再用無菌手術(shù)刀將蒴果剖開，將其中的種子均勻撒在相同配方的培養(yǎng)基上(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L)，每個(gè)處理重復(fù)3次，觀察種子污染率、原球莖誘導(dǎo)率狀況。

1.2.2 假鱗莖誘導(dǎo)原球莖 采用大花蕙蘭健康植株的假鱗莖作為外植體，經(jīng)自來水沖洗干凈后，用75%酒精浸泡約30s后放入0.1%升汞溶液中殺菌10min，然后用無菌水沖洗6～8次。在無菌的條件下將假鱗莖切割成5×5mm大小的團(tuán)塊，將它們分別接種到3種不同的基本培養(yǎng)基MS、1/2MS及改良MS上培養(yǎng)(均添加6-BA 0.5mg/L，NAA 0.1mg/L)，觀察原球莖誘導(dǎo)情況。確定最佳基本培養(yǎng)基后，再使用不同的激素配方6-BA(0.5、1.0、1.5mg/L)、NAA(0.1、0.2、0.5 mg/L)進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.2.3 原球莖的增殖培養(yǎng) 經(jīng)3～4周培養(yǎng)，將外植體周圍產(chǎn)生原球莖團(tuán)塊分切后進(jìn)行繼代培養(yǎng)，可形成更多的原球莖，分別添加椰乳(5%、10%)、香蕉汁(5%、10%)、6-BA(0.5、1.0mg/L)，NAA(0.1、0.5mg/L)作為培養(yǎng)物進(jìn)行試驗(yàn)比對(duì)[4]。此外，原球莖的增殖培養(yǎng)方式采用了液體振蕩培養(yǎng)，固體培養(yǎng)及固、液體交替培養(yǎng)三種不同的培養(yǎng)方式進(jìn)行。其中，固、液交替培養(yǎng)即采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)20d后轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)20d，再轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，依次循環(huán)。液體振蕩培養(yǎng)采用不同轉(zhuǎn)數(shù)(60～70、100～110、130～140r/min)，其他條件同上，每個(gè)處理重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

1.2.4 生根與移栽 采用改良MS培養(yǎng)基添加不同濃度NAA(0.1、0.5mg/L)和IBA(0.1、0.5mg/L)，研究最佳生根配方。待根生長(zhǎng)到2～3cm左右，將裝有試管苗的罐頭瓶打開移出恒溫室進(jìn)行煉苗，7d后，取出試管苗，洗凈根際的培養(yǎng)基，分別移栽入不同的基質(zhì)中(腐殖土∶沙土=1∶1，腐殖土∶棉籽殼=1∶1，腐殖土∶珍珠巖=1∶1，腐殖土∶松針=2∶1)，并在相同的環(huán)境條件下培植，每個(gè)處理重復(fù)3次，篩選最佳的移栽基質(zhì)。

以上室內(nèi)試驗(yàn)的培養(yǎng)基分別加入7.5g/L的瓊脂、20g/L蔗糖，pH值5.4～5.6，置于25±2℃的溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，期間每天補(bǔ)充1500～2000lx光照(利用日光燈補(bǔ)光)12～14h。

2 結(jié)果與分析

2.1不同消毒液及消毒時(shí)間對(duì)無菌播種的影響

消毒處理是無菌播種的第一步，對(duì)大花蕙蘭的組織培養(yǎng)研究有著至關(guān)重要的作用，消毒方法和時(shí)間得當(dāng)，可以減少外植體的污染和材料的損失。從表1可以看出，在相同培養(yǎng)基配方下，使用3種不同的溶液消毒，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率均有明顯的減少，但是原球莖的誘導(dǎo)率也相對(duì)降低。其中，污染率最低的是使用2%次氯酸鈉與0.1%升汞消毒12min，污染率均為16%；原球莖誘導(dǎo)率最高的是使用0.1%升汞處理10min，誘導(dǎo)率為76%。雖然0.1%升汞消毒10min污染率相對(duì)于最低污染率高出4%，但誘導(dǎo)率卻高出20%左右，從外植體材料利用的方面考慮，大花蕙蘭無菌播種在0.1%升汞溶液消毒10min處理下效果最為理想。

表1 不同消毒液及消毒時(shí)間對(duì)無菌播種的影響Tab.1 Effectofdifferentdisinfectantanddisinfectiontimeontheasepticsowing消毒液消毒時(shí)間(min)污染率(%)原球莖誘導(dǎo)率(%)836602%次氯酸鈉1024581216408406410%過氧化氫103452122644836500.1%升汞102076121648

2.2不同基本培養(yǎng)基對(duì)假鱗莖誘導(dǎo)原球莖效果的影響

在激素及濃度配比相同的情況下，將假鱗莖接種于3種不同配方的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，10d左右，假鱗莖開始膨大，20d左右可觀察到假鱗莖周圍有大小不一的黃白色顆粒狀組織，30d左右轉(zhuǎn)為綠色原球莖。從表2 可以看出，MS、1/2MS及改良MS三種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)大花蕙蘭原球莖的產(chǎn)生，誘導(dǎo)期分別為32d、35d和28d，誘導(dǎo)率分別為60%、44%、70%。由此可知，采用改良MS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)原球莖所需時(shí)間最短且誘導(dǎo)率最高，故大花蕙蘭原球莖誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為 改良MS。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)原球莖誘導(dǎo)效果的影響Tab.2 EffectofdifferentmediumontheinductionofPLB培養(yǎng)基種類原球莖誘導(dǎo)期(d)原球莖誘導(dǎo)率(%)MS32601/2MS3544改良MS2870

2.3不同激素濃度配比對(duì)假鱗莖誘導(dǎo)原球莖效果的影響

將假鱗莖接種到含有不同激素濃度配比的改良MS培養(yǎng)基上，不同濃度的6-BA、NAA對(duì)大花蕙蘭原球莖的誘導(dǎo)效果有明顯的區(qū)別(見表3)。當(dāng)6-BA濃度≤1.0mg/L時(shí)，隨著6-BA濃度的增大，誘導(dǎo)率有升高的趨勢(shì)；當(dāng)6-BA濃度為1.5mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率反而下降，可能與細(xì)胞分裂素濃度過高會(huì)抑制原球莖生長(zhǎng)有關(guān)。其中，原球莖誘導(dǎo)率最高可達(dá)86%，其配方為改良MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L。

表3 不同激素濃度配比對(duì)假鱗莖誘導(dǎo)原球莖效果的影響Tab.3 EffectofdifferenthormonecombinationsontheinductionofPLB基本培養(yǎng)基6—BA(mg/L)NAA(mg/L)原球莖誘導(dǎo)率(%)0.50.1560.50.2600.50.5601.00.162改良MS1.00.2781.00.5861.50.1641.50.2681.50.554

2.4不同添加物對(duì)原球莖增殖的影響

將誘導(dǎo)出的大花蕙蘭原球莖為培養(yǎng)原材料，在無菌條件下，選取呈嫩綠色、大小基本一致、生命力處于旺盛時(shí)期的原球莖，切割后接種到增殖培養(yǎng)基上，15d左右開始長(zhǎng)出綠色的原球莖，一般25d左右，原 球莖增殖系數(shù)基本穩(wěn)定。從表4可以看出，4種不同的添加物單一或者組合均能誘導(dǎo)大花蕙蘭原球莖的增殖，但是增殖效果各有不同。其中，增殖效果最好的是椰子汁10%+NAA 0.5mg/L，增殖系數(shù)達(dá)到了4.7；其次為單一的NAA 0.5mg/L和香蕉汁10%+NAA 0.5mg/L，增殖系數(shù)均為4.5?？偟膩碚f，在NAA 濃度為0.5mg/L的情況下，大花蕙蘭的增殖效果均比較好。6-BA對(duì)大花蕙蘭的原球莖增殖效果不如NAA?？紤]到采用椰子原汁具有較強(qiáng)的季節(jié)性，且花費(fèi)較高，而且僅用NAA 0.5mg/L，也能達(dá)到4.5的增殖系數(shù)，因此，原球莖增殖采用改良MS+NAA 0.5mg/L的配方較好。

表4 不同添加物對(duì)原球莖增殖的影響Tab.4 EffectofdifferentadditivesonthemultiplicationofPLB編號(hào)添加物椰子汁(%)香蕉汁(%)6—BA(mg/L)NAA(mg/L)增殖系數(shù)152.92104.3353.04103.850.52.761.02.870.13.280.54.5950.53.61050.13.311100.14.212100.54.71350.53.71450.13.315100.13.916100.54.5170.50.13.5180.50.53.6191.00.13.1201.00.54.0

2.5不同培養(yǎng)方式對(duì)原球莖繼代增殖的影響

原球莖在固體增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)25d左右將會(huì)長(zhǎng)出叢生芽，而不利于繼續(xù)增殖，為保證生產(chǎn)效率，在20d左右時(shí)需繼代一次，即將誘導(dǎo)的原球莖切割后繼續(xù)培養(yǎng)，防止叢生芽產(chǎn)生。從表5可以看出，采用單一的固體或者液體培養(yǎng)，原球莖的增殖系數(shù)均不高，分別為3.6和2.2；而采用固、液體交替培養(yǎng)，增殖系數(shù)可達(dá)5.2。試驗(yàn)表明采用交替培養(yǎng)能有效地防止叢生芽的生成和提高原球莖的增殖效果。此外，從表6可知，液體培養(yǎng)中不同的振蕩轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)原球莖的增殖效果也不同，轉(zhuǎn)數(shù)為60～70r/min，原球莖增殖系數(shù)僅為2.8，明顯低于轉(zhuǎn)數(shù)100～110r/min與130～140r/min時(shí)的5.2和5.0。這可能由于振蕩轉(zhuǎn)數(shù)過低，導(dǎo)致部分原球莖長(zhǎng)期淹沒于液體培養(yǎng)基中而造成缺氧，從而影響了原球莖的增殖。轉(zhuǎn)數(shù)100～110r/min與130～140r/min時(shí)，增殖系數(shù)沒有太大的差別，但是從節(jié)電角度及噪聲角度考慮，轉(zhuǎn)數(shù)100～110r/min的振蕩培養(yǎng)更加適合。

表5 不同培養(yǎng)方式對(duì)原球莖增殖的影響Tab.5 Effectofdifferentculturemethodsonthemultipli-cationofPLB培養(yǎng)方式原球莖增殖系數(shù)固體培養(yǎng)3.6液體培養(yǎng)2.2固、液交替培養(yǎng)5.2

表6 不同振蕩轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)原球莖增殖的影響Tab.6 Effectofdifferentrevolutionnumbersonthemul-tiplicationofPLB轉(zhuǎn)數(shù)(r/min)原球莖增殖系數(shù)60～702.8100～1105.2130～1405.0

2.6不同激素濃度對(duì)生根的影響

繼代培養(yǎng)基中的原球莖在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20d左右，開始分化形成小苗,待小苗長(zhǎng)至2～3cm高時(shí)，移至生根培養(yǎng)基上，約5～7d左右可見下部葉腋中稍膨大，出現(xiàn)綠色根原基，10d后可發(fā)現(xiàn)明顯生根，30d后根長(zhǎng)2～3cm可出瓶移栽。不同激素的培養(yǎng)基配方對(duì)大花蕙蘭無菌生根的影響見表7。無論是生根率還是生根狀況方面，添加了NAA的培養(yǎng)基效果都要好于IBA和不添加激素的改良MS。其中培養(yǎng)基配方為改良MS+NAA 0.5mg/L的誘導(dǎo)生根效果最佳，生根率達(dá)到99%，且生根數(shù)量多且粗壯。

2.7不同基質(zhì)配比對(duì)移栽苗成活率的影響

在植物的組織培養(yǎng)中，試管苗的移栽也是至關(guān)重要的一步。從表8可以看出，不同移栽基質(zhì)配比對(duì)大花蕙蘭移栽苗成活率的影響各不相同。其中，最佳移栽基質(zhì)配比為腐殖土∶棉籽殼=1∶1的混合物，移栽苗成活率可達(dá)95%；其次為腐殖土∶珍珠巖=1∶1的混合物。

表7 不同激素濃度對(duì)生根的影響Tab.7 Effectofdifferenthormoneconcentrationontherooting培養(yǎng)基配方生根率(%)生根效果改良MS75生根數(shù)量較少,且根較細(xì)弱改良MS+NAA0.1mg/L80生根數(shù)量較多,但根較細(xì)弱改良MS+NAA0.5mg/L99生根數(shù)量多且粗壯改良MS+IBA0.1mg/L82.5生根數(shù)量較少,且根較細(xì)弱改良MS+IBA0.5mg/L87.5生根數(shù)量較多,但根較細(xì)弱

表8 不同基質(zhì)配比對(duì)移栽苗成活率的影響Tab.8 Effectofdifferentsubstratecompositionsonthesurvivalrateoftransplantseedlings編號(hào)基質(zhì)配比移栽成活率(%)1腐殖土∶沙土=1∶1752腐殖土∶棉籽殼=1∶1953腐殖土∶珍珠巖=1∶1904腐殖土∶松針=2∶170

3 結(jié)論與討論

(1) 大花蕙蘭無菌播種的滅菌過程中，采用0.1%升汞溶液滅菌10min能取得較好的效果，這與其它相關(guān)報(bào)道基本一致[2,5]。但是，由于升汞殘毒較難去除，因此，需用無菌水沖洗6～8次去殘毒的效果較好。

(2) 采用改良MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L培養(yǎng)基對(duì)大花蕙蘭假鱗莖誘導(dǎo)原球莖效果較好。一般認(rèn)為細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值較高有利于原球莖的誘導(dǎo)，這與國(guó)內(nèi)許多報(bào)道的結(jié)論基本一致[5-7]。但亦有相反，如錢張等[8]報(bào)道的大花蕙蘭原球莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L ，所用生長(zhǎng)素濃度反而較高，這可能與物種個(gè)體差異有關(guān)。

(3) 大花蕙蘭原球莖增殖最佳培養(yǎng)基為改良MS+NAA 0.5mg/L。采用固、液體交替培養(yǎng)(液體培養(yǎng)振蕩轉(zhuǎn)數(shù)100～110r/min)，交替周期為20d，能有效地提高原球莖的增殖效率，這與楊玉珍等[9]的研究結(jié)論基本相符。

(4) 改良MS+NAA 0.5mg/L培養(yǎng)基對(duì)大花蕙蘭的壯苗生根同樣最為合適。大花蕙蘭移栽苗的成活效果最佳的基質(zhì)配比為腐殖土∶棉籽殼=1∶1，從結(jié)果來看，一般疏松透氣，且保濕效果較好的基質(zhì)均可作為大花蕙蘭組培苗的移栽基質(zhì)。

國(guó)內(nèi)在大花蕙蘭組織培養(yǎng)和快速繁殖方面進(jìn)行了較多報(bào)道，許多研究[5-7，9-10]存在與我們?cè)囼?yàn)類似或者不同的結(jié)論。當(dāng)然，這與植株個(gè)體差異及試驗(yàn)誤差也有一定的關(guān)系。我們?nèi)孕杓訌?qiáng)大花蕙蘭組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)的研究，同時(shí)在此基礎(chǔ)上，加強(qiáng)遺傳雜交育種方面的研究，早日培育出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的大花蕙蘭新品種。

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(文字編校：張 珉，楊 駿)

AsepticsowingandtissuecultureofCymbidiumhybridum

LI Maojuan， TAN Baitao， DENG Shaohua， WANG Hualong

(Forestry Institute of Chenzhou City, Chenzhou 423000, China)

The aseptic sowing and tissue culture ofCymbidiumhybridumwere studied for rapid propagation ofC.hybridum. The results showed that the disinfection treatment with 0.1%HgCl2solution for 10 min was most suitable for aseptic sowing.The suitable medium for protocorm-like body (PLB) induction was modified MS +6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L, the inductive rate reached 86%.The optimum medium for PLB propagation was modified MS +NAA 0.5mg/L, which was also suitable for root growing.Liquid and solid medium alternation culture with shaking of 100～110r/min could effectively promote the PLB propagation.The suitable transplanting medium was humus soil∶cotton seed hull=1∶1, the survival rate of transplanting seedlings reached 95%.

Cymbidiumhybridum; aseptic sowing; tissue culture; protocorm-like body (PLB); alternation culture

2012-03-05

2012-05-30

李茂娟(1985-)，女，湖南省郴州市人，碩士研究生，主要從事植物組培快繁技術(shù)研究。

S 682.31

A

1003-5710(2012)03-0026-04

10. 3969/j. issn. 1003-5710. 2012. 03. 007