苯丁酸鈉對胃癌細(xì)胞株SGC-7901的增殖抑制作用

劉 奇 陳德興 趙吉生 (吉林省前衛(wèi)醫(yī)院普外科，吉林 長春 3002)

苯丁酸鈉對胃癌細(xì)胞株SGC-7901的增殖抑制作用

劉 奇 陳德興 趙吉生1(吉林省前衛(wèi)醫(yī)院普外科，吉林 長春 130012)

目的 研究苯丁酸鈉(SPB)在體外對胃癌細(xì)胞株SGC-7901生長、分化的影響。方法 應(yīng)用MTT分析法、流式細(xì)胞儀、形態(tài)學(xué)觀察法對在體外經(jīng)不同濃度的SPB處理過的SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行檢測。結(jié)果 SPB能抑制SGC-7901細(xì)胞的生長，并且有時間依賴關(guān)系及劑量依賴關(guān)系;應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SPB處理的細(xì)胞其S期在16.48%，而未經(jīng)處理的細(xì)胞其S期在31.07%;電子顯微鏡觀察，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。結(jié)論SPB在體外抑制胃癌細(xì)胞株SGC-7901的生長，為SPB治療胃腫瘤提供了實驗依據(jù)。

苯丁酸鈉;SGC-7901;生長抑制

苯丁酸鈉(SPB)作為一種誘導(dǎo)分化劑，對多種腫瘤具有誘導(dǎo)分化和殺傷作用，通過抑制組蛋白脫乙酰基酶誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞生長，以改變?nèi)旧|(zhì)和基因表達(dá)。其分化作用已被證明是通過誘導(dǎo)G0/G1終末分化以及誘導(dǎo)與分化有關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)關(guān)鍵點p21WAF1而實現(xiàn)的。SPB在體內(nèi)經(jīng)β氧化轉(zhuǎn)變成苯乙酸鈉(PA)，后者又可與血漿中谷氨酰胺合成苯乙酰谷氨酰胺(PAG)。目前發(fā)現(xiàn)SPB對喉癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、白血病和淋巴瘤、黑色素瘤、肝癌、腦腫瘤均有作用，本文擬探討SPB在體外對胃癌細(xì)胞株SGC-7901生長、分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，購自上海生物制品研究所。培養(yǎng)于含20%小牛血清(FCS)(杭州四季青生物工程材料研究所)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱37℃，每3～4 d傳代一次，每24 h換液一次。SPB分子式C10H11O2Na，分子量186.2，本品為無色無味固體，RPMI1640培養(yǎng)液配制成儲存液，－20℃保存。本品自晶美生物有限公司。MTT購于華美生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定SPB對SGC-7901細(xì)胞的抑制率 將5×104/ml接種于96孔板中，100 μl/孔，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)過夜(細(xì)胞完全貼壁)后，加入SPB，20 μl/孔，細(xì)胞對照孔加等量無血清培養(yǎng)液代之。各孔補充含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，使終體積為200 μl，每組設(shè)6個復(fù)孔，另設(shè)只加培養(yǎng)液的空白對照組。SPB終濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L，0 mmol/L作為兩藥的陰性對照組。3 d后每孔加人20 μl MTT，于37℃的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄上清加人150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻10 min，使紫藍(lán)色沉淀充分溶解，采用全自動酶標(biāo)儀在波長570 nm處測吸光值(A值)。

1.2.2 流式細(xì)胞儀分析 將濃度為1×106/ml的細(xì)胞加入6孔培養(yǎng)板，1 ml/孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，向各孔內(nèi)加入受試藥物并置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h消化各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min;PBS洗滌2次，PBS重懸細(xì)胞;加入50 μl RNase A(10 g/L)，室溫 下孵育 30 min; 加 入 500 μl 100 mg/L PI染色液(0.01 mol/L PBS溶液，4℃避光保存)，旋轉(zhuǎn)混勻，置4℃避光孵育30 min;上機測試，軟件分析。

1.2.3 電子顯微鏡觀察SGC-7901細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

SGC-7901細(xì)胞在25 cm2培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，加入 SPB 4.0 mmol/L此日被視為第0天。用0.25%的胰酶消化，消化前倒置顯微鏡下先拍片。0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，離心1 500 r/min。離心10 min后取離心管，底部細(xì)胞團(tuán)塊切成約1.5 mm3大小，經(jīng) 2.5%戊二醛前固定后，乙醇系列脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，LKB-Ⅲ型超薄切片機半薄切片定位后做超薄切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，JEM-1200EX型透射電鏡觀察，攝片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MTT法測定SPB對SGC-7901細(xì)胞生長的抑制作用

胃癌細(xì)胞 SGC-7901 經(jīng)0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mmol/L 的 SPB作用24、48、72 h的檢測結(jié)果，除了4.0 mmol/L濃度的SPB作用于SGC-7901細(xì)胞48 h、72 h兩者之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其他各組均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，即隨著SPB用藥劑量的增加和作用時間的延長，所測得的增殖抑制率升高越明顯。表明SPB對胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖呈時間和劑量依賴性抑制作用。見表1。

2.2 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期

4.0 mmol/L SPB作用72 h后G0/G1期明顯增加，S期減少(P＜0.05)。表明SPB抑制了SGC-7901細(xì)胞分裂和DNA的合成，細(xì)胞周期出現(xiàn)G0/G1期阻滯。見表2。

表1 不同濃度SPB作用后的SGC-7901細(xì)胞在不同時間的抑制率(%)

表2 SPB用藥作用72 h對SGC-7901細(xì)胞周期的影響(%)

2.3 電子顯微鏡測定SPB對SGC-7901細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖1 電子顯微鏡檢測SGC-7901細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

圖1可見，電子顯微鏡下觀察對照組SGC-7901細(xì)胞呈多型性，表面有許多微絨毛，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核形細(xì)胞核較大，核質(zhì)比明顯增大;有的胃癌細(xì)胞核圓形、橢圓形或不規(guī)則形，多個細(xì)胞核，核仁明顯;觀察胃癌細(xì)胞局部情況發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體豐富，符合胃癌細(xì)胞高增殖的特點。應(yīng)用SPB 4.0 mmol/L作用72 h后SGC-7901細(xì)胞固縮，表面微絨毛消失，可見多個鈍性突起，細(xì)胞核不規(guī)則，核內(nèi)異染色體略增多，核基質(zhì)輕度改變，糖原顆粒增多，線粒體改變;有些細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)存在較多空泡;有些細(xì)胞局部細(xì)胞呈不規(guī)則形改變，核內(nèi)異染色體增多，胞質(zhì)改變，空泡增多;一部分細(xì)胞呈現(xiàn)空化狀，核圓，核基質(zhì)空化，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體和溶酶體腫脹。說明SPB對胃癌細(xì)胞株SGC-7901的增殖起了抑制作用。

3 討論

SPB起初發(fā)現(xiàn)可治療新生兒腦病，并可作為一種氨清除劑治療尿素循環(huán)紊亂疾病〔1〕;近年來發(fā)現(xiàn)其可作為一種誘導(dǎo)分化劑，對多種腫瘤具有誘導(dǎo)分化和殺傷作用，但劑量過大對實體腫瘤無效用〔2〕。它的抗腫瘤作用機制主要表現(xiàn)在：(1)PPAR的激活：PPARs屬于核類固醇受體超家族，是一種核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子，有三種亞型：PPARα、PPARβ和 PPARγ。PPARs激活后可抑制 cyclinD1，cyclinB、cyclinE，CDKIP21蛋白表達(dá)，阻滯細(xì)胞分裂增殖和CDK4表達(dá)，并上調(diào)CD-KIP21和P27蛋白表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞生長〔3〕。(2)活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和促進(jìn)激活蛋白-1(AP-1)轉(zhuǎn)錄：ERK是三種促分裂原激活蛋白激酶(MAPKs)中的一種。MAPK信號傳導(dǎo)通路是典型的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化方式，可以激活ERK。蛋白激酶C(PKC)、ras-GTP可磷酸化激活 Raf-l激酶，后者磷酸化激活MAPK，進(jìn)而將 MAPK/ERK1激酶(MEKl)和 MEK2激活。MEK1和MEK2的活化則可進(jìn)一步磷酸化ERK，從而活化其下游的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子AP-1。C-jun是AP-1家族中含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，它能與自身或其他家族成員JunD、c-Fos和ATF-2形成二聚體，并與DNA結(jié)合位點結(jié)合使相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄激活〔4〕。(3)抑制p21ras蛋白的異戊烯化及膽固醇的合成，由于膽固醇和異戊二烯是瘤細(xì)胞生長所必需的，因而他們合成的減少也對體內(nèi)腫瘤生長起抑制作用。本文發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度的SPB作用后的SGC-7901細(xì)胞，細(xì)胞生長抑制表現(xiàn)出明顯的時間劑量依從性，說明SPB具有調(diào)節(jié)胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖和分化能力，預(yù)示在治療胃癌腫瘤方面SPB具有良好的前景。

1 Lee B，Rhead W，Diaz GA，et al.Phase 2 comparison of a novel ammonia scavenging agent with sodium phenylbutyrate in patients with urea cycle disorders：safety，pharmacokinetics and ammonia control〔J〕.Mol Genet Metab，2010;100(3)：221-8.

2 Lin J，Gilbert J，Rudek MA，et al.A phase I dose-finding study of 5-azacytidine in combination with sodium phenylbutyrate in patients with refractory solid tumors〔J〕.J Clin Cancer Res，2009;15(19)：6241-9.

3 潘華鋒，陳孝平.Ciglitazone抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖活性的實驗研〔J〕.中華實驗外科雜志，2004;21(8)：934-6.

4 孫象軍.苯丁酸鈉及二甲基甲酰胺對乳腺癌細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)分化的實驗研究〔D〕.吉林大學(xué)，2007.

R735.2

〕 A

〕 1005-9202(2012)22-4960-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.050

1 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院

劉 奇(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事肝膽外科疾病的診治研究。

〔2012-01-10收稿 2012-02-10修回〕

(編輯 徐 杰)