TLR4、MyD88mRNA在膽脂瘤型中耳炎中的表達(dá)

楊珍珍 張莉萍

（山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030001）

盡管中耳膽脂瘤的成因及其上皮的來源仍存在很多爭(zhēng)議，但基本達(dá)成共識(shí)的是膽脂瘤的形成與機(jī)體為防御慢性炎癥而產(chǎn)生的一系列異常免疫應(yīng)答有關(guān)。免疫反應(yīng)的異常是造成膽脂瘤持續(xù)發(fā)展和骨質(zhì)破壞的內(nèi)在重要因素[1,2]。Toll樣受體（toll.1ikereceptors，TLRs）是先天性免疫模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）之一，通過識(shí)別病原微生物及其細(xì)胞壁產(chǎn)物的特殊結(jié)構(gòu)即病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecularpatterns，PAMPs）迅速激活天然免疫系統(tǒng)[3]?，F(xiàn)Szczepanski等[4]研究發(fā)現(xiàn)TLR（TLR-2，TLR-3，TLR-4）在膽脂瘤微環(huán)境中表達(dá)豐富，提示TLR4可能參與膽脂瘤型中耳炎的發(fā)病。本實(shí)驗(yàn)擬用RT-PCR法觀察中耳膽脂瘤組織中TLR4的變化及其下游傳導(dǎo)分子MyD88的表達(dá)，進(jìn)一步探討TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在中耳膽脂瘤發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

中耳炎組標(biāo)本組織來自山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科住院患者35例（男13例，女22例，年齡16～62歲）平均37.12歲，耳流膿史1個(gè)月～30年，平均5.14年；聽骨無破壞者8例，破壞1個(gè)8例，破壞2個(gè)13例，破壞3個(gè)6例。在術(shù)中取標(biāo)本時(shí)根據(jù)顯微鏡下所見上皮下基質(zhì)炎性反應(yīng)的程度，取樣分為炎癥組和非炎癥組，其中炎癥組13份，非炎癥組12份。對(duì)照組為正常外耳道皮膚組織10例，亦取自中耳術(shù)中。上述所有標(biāo)本在顯微鏡下仔細(xì)剔除膽脂瘤鱗屑及其他壞死組織，置于一80℃冰箱保存，用作RT-PCR檢測(cè)。所有患者術(shù)前均行顳骨高分辨CT檢查，術(shù)后病理活檢均證實(shí)為后天繼發(fā)性膽脂瘤。

1.2 主要試劑與儀器

RT-PCR相關(guān)試劑（TAKARA公司）.引物合成（深圳華大基因研究所），引物序列如表1。PCR擴(kuò)增儀為STRATAGENE公司產(chǎn)品。

表1 3種基因的引物序列及產(chǎn)物基因

1.3 總RNA制備和逆轉(zhuǎn)錄

取組織50mg，加入1mL Trizol，超聲勻漿。加入200μL氯仿，劇烈振蕩混勻30s，于4℃ 12000rpm離心5min，將上清液移入另一EP管中，加入等體積異丙醇，室溫放置5min，4℃ 12000rpm離心5min以沉淀RNA，用70%乙醇1mL洗滌沉淀2次，4℃ 12000rpm離心2min，EP管底部可得RNA沉淀，用50μL 0.1%DEPC水溶解后可作為反轉(zhuǎn)錄的模板。cDNA合成按Rever Tra Ace-a-逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明完成。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR

PCR反應(yīng)體系為：FastStart Universal SYBR Green Master （ROX）10μL，上游引物（15uM）0.5μL，下游引物（15uM）0.5μL，cDNA 2μL，無DNAse和RNAse的水7μL，共20μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10min，活化Tag酶；94℃15s，60℃60 s，45個(gè)循環(huán)結(jié)束。熒光定量PCR讀取CT（cycle threshold）值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用2-ΔΔCT法處理實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR數(shù)據(jù)，采用SPSSl3.0 for windows軟件包處理獲得的數(shù)據(jù)，以Explore過程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行探索性分析，由于實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本值2-ΔΔCT不符合正態(tài)分布，以非參數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以中位數(shù)和最大最小值范圍來表示，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TLR4水平的改變

炎癥組TLR4平均2-ΔΔCT值分別為0.689（0.200，2.050），非炎癥組TLR4平均2-ΔΔCT值分別為0.291（0.020，0.990），正常對(duì)照組TLR4、平均2-ΔΔCT值分別為0.163（0.001，0.990）。見圖1。

圖1 炎癥組、非炎癥組、正常對(duì)照組TLR4 mRNA的表達(dá)

2.2 MyD88水平的改變

炎癥組為MyD88平均2-ΔΔCT值0.777（0.320，1.84）；非炎癥組MyD88平均2-ΔΔCT值為0.320（0.01，0.990），正常對(duì)照組MyD88平均2-ΔΔCT值為0.224（0.002，0.990），見圖2。

圖2 炎癥組、非炎癥組、正常對(duì)照組MyD88 mRNA的表達(dá)

3 討 論

慢性化膿性中耳炎是耳鼻咽喉科一個(gè)常見的疾病，膽脂瘤型中耳炎是中耳慢性化膿性炎的一個(gè)類型，發(fā)病率占慢性化膿性中耳炎的20%，它主要以上皮細(xì)胞增生、角化上皮脫屑堆積為特征，雖然其不產(chǎn)生與惡性腫瘤同樣的無限增殖，但它可以引發(fā)骨破壞，激發(fā)蝕骨，侵略性地侵蝕中耳及內(nèi)耳的結(jié)構(gòu)，引起嚴(yán)重的顱內(nèi)并發(fā)癥，如并不少見的永久性的聽力損失、 前庭功能障礙等，嚴(yán)重危害人類健康。大多數(shù)學(xué)者把膽脂瘤骨質(zhì)破壞的機(jī)制解釋為慢性炎性作用的結(jié)果。Suzuki等[5]發(fā)現(xiàn)，膽脂瘤囊的破裂可引起局部炎癥和骨質(zhì)破壞，并伴隨著相同部位小膿腫的形成，他們還觀察到穿孔部位有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和上皮增殖，說明了膽脂瘤骨質(zhì)破壞與炎癥之間的聯(lián)系。

馬鑫[6]等研究發(fā)現(xiàn)，膽脂瘤原發(fā)部位的差別對(duì)于膽脂瘤的侵襲性沒有明顯影響，主要是伴發(fā)炎性反應(yīng)的輕重對(duì)于膽脂瘤的預(yù)后以及侵襲性有明顯影響，膽脂瘤周圍炎性反應(yīng)越重，侵襲性越強(qiáng)?；谝陨希私饽懼龅难装Y反應(yīng)機(jī)制，尤為重要。

1997年，Medzhitov等[7]首次在人類細(xì)胞表現(xiàn)了Toll樣受體，TLR的發(fā)現(xiàn)對(duì)免疫學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了積極而深遠(yuǎn)的影響。TLR最突出的生物學(xué)功能是促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放，引發(fā)炎性反應(yīng)。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)在膽脂瘤微環(huán)境中，有大量TLR4的表達(dá)，本研究根據(jù)顯微鏡下觀察膽脂瘤上皮下基質(zhì)，將中耳膽脂瘤組分為炎癥組和非炎癥組，發(fā)現(xiàn)在炎癥程度強(qiáng)的組織中，有大量的TLR4表達(dá)，而在炎癥程度相對(duì)較弱的膽脂瘤組織中，有TLR4的表達(dá)，但明顯少于炎癥組；相比較膽脂瘤組，正常對(duì)照組僅有微量表達(dá)。

TLR4識(shí)別配體后發(fā)生二聚化，二聚體的刺激信號(hào)通過胞內(nèi)Toll/IL-1 R區(qū)（Toll/IL-1 R domain，TIR）傳遞給下游的信號(hào)分子經(jīng)過一系列蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)和磷酸化作用，產(chǎn)生炎性反應(yīng)[8]。目前發(fā)現(xiàn)TLR4信號(hào)通路有2條：一條為MyD88依賴信號(hào)途徑，另一條為MyD88非依賴信號(hào)途徑。在MyD88依賴途徑中，TLR4寡聚化后募集含TIR（Toll-interleukin-1receptor）結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白TIRAP （TIP domain-containing adaptor protein）和MyD88。然后MyD88下游的接頭蛋白IRAK4（IL-1 receptor-associated kinase-4）、TRAF6（TNF report-associated factor 6）和TAKl（TGFβ-activated kinase 1）被募集并活化，而TAKl激活I(lǐng)KK-NF-κB通路和MAPK通路，最終導(dǎo)致前炎性因子的表達(dá)[9]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，同TLR4一樣，MyD88在炎癥組中有大量表達(dá)，非炎癥組次之，正常對(duì)照組有微量表達(dá)。說明在膽脂瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，TLR4-MyD88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能參與了炎性反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在膽脂瘤中耳炎過程中，膽脂瘤組織內(nèi)TLR4、MyD88的表達(dá)量隨著炎癥程度的加重而增多。這有助于對(duì)人天然免疫和獲得性免疫啟動(dòng)的認(rèn)識(shí)，并進(jìn)一步了解TLR4傳導(dǎo)通路在膽脂瘤型中耳炎發(fā)病機(jī)制中的作用。而且可以為該病的免疫治療提供理論依據(jù)。如：在膽脂瘤發(fā)病早期（慢性化膿性中耳炎）時(shí)就進(jìn)行免疫干預(yù)治療，阻止或延緩疾病的發(fā)展。

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