水飛薊素對(duì)小鼠肝損傷保護(hù)作用及機(jī)理研究

黃彩玲 肖柳英 潘競(jìng)鏘

1.廣東省從化市中心醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州 510900;2.廣東省廣州市中醫(yī)醫(yī)院 (中醫(yī)中藥研究所)，廣東 廣州 510130

水飛薊素對(duì)小鼠肝損傷保護(hù)作用及機(jī)理研究

黃彩玲1肖柳英2潘競(jìng)鏘2

1.廣東省從化市中心醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州 510900;2.廣東省廣州市中醫(yī)醫(yī)院 (中醫(yī)中藥研究所)，廣東 廣州 510130

目的:探討水飛薊素對(duì)小鼠免疫性肝炎及實(shí)驗(yàn)性肝損傷保護(hù)作用。方法:小鼠iv卡介苗 (BCG)5×106個(gè)菌/鼠;11天后再iv脂多糖 (LPS)7.5pg/只，造成免疫性肝炎模型及對(duì)小鼠四氯化碳 (CCL4)和硫代硫酰胺 (TAA)所引起實(shí)驗(yàn)性中毒模型;觀察水飛薊素對(duì)免疫性肝炎及四氯化碳和硫代硫酰胺致實(shí)驗(yàn)性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。結(jié)果:水飛薊素和聯(lián)苯雙酯兩藥能明顯降低免疫性肝炎及實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型小鼠血清谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)的作用 (P＜0.01);血清的超氨化物岐化酶 (SOD)的活性升高、丙二醛及機(jī)理 (MDA)和一氧化氮 (NO)含量明顯降低。結(jié)論:水飛薊素對(duì)小鼠免疫性肝炎及實(shí)驗(yàn)性肝損傷有保護(hù)作用。

水飛薊素;免疫性肝炎;實(shí)驗(yàn)性肝損傷

水飛薊 (Silybum marianum L.Gaertn)，是菊科水飛薊屬草本植物，原產(chǎn)于南歐、北非［1］。水飛薊是歐洲民間的一種草藥，用于治療肝膽疾病。我國(guó)早在20世紀(jì)50年代初就引入了水飛薊，但僅用于觀賞，直到20世紀(jì)60年代末以H.Wagner為代表的德國(guó)藥學(xué)家，對(duì)其有效成分進(jìn)行提取后，我國(guó)才將它作為一種保肝藥用植物推廣種植。其中，以水飛薊賓含量最高，活性也最強(qiáng)。它具有保肝［2］降血脂、抗氧化［3］。為此，我們進(jìn)一步探討水飛薊素對(duì)小鼠免疫性肝炎及急性肝損傷的藥理學(xué)機(jī)理的影響及預(yù)防和治療作用的可能性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物 NIH小鼠，體質(zhì)量20±1.6g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;SD大鼠:使用許可證SYXK［粵］2008－0002生產(chǎn)許可證SCXK［粵］2008－0002。

1.2 藥物 水飛薊素由江蘇中興藥業(yè)有限公司出品，批號(hào)20070303?？ń槊?(BCG):由廣東省結(jié)核病防治研究所生產(chǎn)，批號(hào):20080613－7。脂多糖 (LPS)由晶美生物工程廣州分公司產(chǎn)品。硫代乙酰胺 (TAA)分析純，由中國(guó)醫(yī)藥 (集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司提供，批號(hào):20070315。四氯化碳 (CCL4)分析純，由廣州市新港化工有限公司提供，批號(hào):2007028?；ㄉ陀煞吓d油脂有限公司提供，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)GB153486生產(chǎn)，批號(hào):2008028。聯(lián)苯雙酯由廣州市市橋藥業(yè)有限公司 (原市橋制藥廠)生產(chǎn)，批號(hào):080812。丙二醛 (MDA)測(cè)定試劑盒由南京建成生物所生產(chǎn)，批號(hào):20080716。超氧化物歧化酶 (SOD)測(cè)定試劑盒由南京建成生物所生產(chǎn)，批號(hào):20080413。一氧化氮(NO)測(cè)定試劑盒由南京建成生物所生產(chǎn)，批號(hào):20080403。

1.3 儀器 BIO－TEK ELX－800酶標(biāo)儀;日本奧林巴斯AU－400－生化分析儀。

2 實(shí)驗(yàn)方法［4－5］

2.1 水飛薊素對(duì)小鼠免疫性肝炎的保護(hù)作用 取NIH小鼠100只，雌雄各半，分成5組:正常對(duì)照組，空白模型組，聯(lián)苯雙酯組 (150mg/kg·d)，水飛薊素高劑量組 (0.3g/kg·d)，水飛薊素低劑量組 (0.15g/kg·d)。各組小鼠分別以0.2 ml/10g灌胃給藥 (正常對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠用等量的蒸餾水灌胃)，每天灌胃1次，連續(xù)給藥11d。同時(shí)，除正常對(duì)照組外，其余4組小鼠在灌胃給藥的當(dāng)天在小鼠尾分別靜脈注射 (iv)BCG 5×106個(gè)菌/鼠;在第11天末次給藥前的16小時(shí)靜脈注射 (iv)脂多糖 (LPS)7.5ug/鼠，造成免疫性肝炎模型，以觀察水飛薊素對(duì)小鼠免疫性肝炎的保護(hù)作用。在給藥的第12天全部小鼠眼眶放血，離心血清，測(cè)定ALT、AST、SOD、MDA、NO等生化指標(biāo)。

2.2 水飛薊素對(duì)四氯化碳 (CCL4)致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用 取NIH小鼠100只，雌雄各半，分成5組:正常對(duì)照組，空白模型組，聯(lián)苯雙酯組 (150mg/kg·d)，水飛薊素高劑量組 (0.3g/kg·d)，水飛薊素低劑量組(0.15g/kg·d)。各組小鼠分別以0.2 ml/10g灌胃給藥 (正常對(duì)照組及空白模型組分別灌胃等量的蒸餾水)，每天灌胃1次，連續(xù)給藥8d。在第8天給藥1小時(shí)后，正常對(duì)照組腹腔注射花生油，其余4組小鼠分別以0.1ml/10g進(jìn)行腹腔注射0.1%四氯化碳，造成急性肝損傷模型，以觀察水飛薊素對(duì)CCL4致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。各組小鼠在染毒20小時(shí)后，眼眶放血，離心血清，分別測(cè)定ALT、TP、GLB、AST生化指標(biāo)與SOD、NO和MDA含量。

2.3 水飛薊素對(duì)硫代乙酰胺 (TAA)致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用 取NIH小鼠100只，雌雄各半，動(dòng)物分組，給藥方法、劑量及時(shí)間同實(shí)驗(yàn)方法2.2。末次給藥1h后，除正常對(duì)照組腹腔注射花生油 (0.5ml/只)外，其余各組分別進(jìn)行腹腔注射TAA(50mg/kg)0.5ml/只，造成急性肝損傷模型，以觀察水飛薊素對(duì)TAA致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。各組小鼠在染毒20小時(shí)后，眼眶取血，離心血清，分別測(cè)定ALT、ALB、AST、TP、MDA、SOD和NO含量。

3 結(jié)果

3.1 水飛薊素對(duì)小鼠免疫性肝炎的保護(hù)作用 正常對(duì)照組的SOD、NO和MDA含量與空白模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，說明本實(shí)驗(yàn)的造模是成功的。水飛薊素的高、低劑量組及聯(lián)苯雙酯組均能降低致免疫性肝炎模型小鼠血清的ALT、AST和ALB活性的升高， (P＜0.01);但TP沒有差異，血清SOD活性升高，血清MDA和NO的含量明顯降低。結(jié)果見表1。

表1 水飛薊素對(duì)小鼠免疫性肝炎保護(hù)作用 (±SD)

表1 水飛薊素對(duì)小鼠免疫性肝炎保護(hù)作用 (±SD)

注: 同模型組比較，＊P＞0.05，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量(g/kg·d)ALT(IU·L－1)AST(IU·L－1)TP(g·L－1)ALB(g·L－1)MDA(U/nnol)SOD(U/ml)NO(μmol/g pro)10.12±0.55模型組 144.52±1.55 172.21±5.02 42.89±3.23 18.88±2.32 36.52±1.25 94.11±4.55 30.66±1.80聯(lián)苯雙酯 0.15 81.23±12.43＊＊ 113.11±2.23＊＊ 59.91.±5.23 28.42±4.12＊＊ 18.12±0.42＊＊167.15±5.33＊＊＊18.73±0.71＊＊＊水飛薊素高劑量 0.30 91.32± 2.12＊＊ 129.21±2.13＊＊ 51.47.±3.33 27.31±3.22＊＊ 22.21±3.54＊＊138.77±29.72＊＊20.94±0.21＊＊＊水飛薊素低劑量 0.15 99.13± 2.13＊＊133.14±3.11＊＊ 57.12±8.66 31.21±5.52＊＊ 24.06±3.02＊＊ 151.24±5.21＊＊ 24.89±1.21對(duì)照 86.20±1.53＊＊ 110.22±3.12＊＊ 66.51±2.31 34.12±0.86 21.21±0.32 127.62±6.55*＊＊

3.2 水飛薊素對(duì)CCL4致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用 正常對(duì)照組的SOD、NO和MDA含量與空白模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，說明本實(shí)驗(yàn)的造模是成功的;各組小鼠血清中AL T和A ST活性變化CCl4模型組的ALT和AST活性較正常對(duì)照組明顯升高 (P＜0.01)，與模型組比較，ALT和AST活性均有明顯下降 (P＜0.01)。水飛薊素高、低劑量組及聯(lián)苯雙酯組均能明顯降低CC14急性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST和GLB(P＜0.01)，但TP沒有差異，血清MDA和NO含量的明顯降低，血清的超氧化物歧化酶 (SOD)的活性均升高，結(jié)果見表2。

表2 水飛薊素對(duì)CCL4小鼠急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究(+SD)

表2 水飛薊素對(duì)CCL4小鼠急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究(+SD)

組別 劑量(g/kg·d)ALT(IU·L－1)AST(IU·L－1)TP(g·L－1)ALB(g·L－1)MDA(U/nnol)SOD(U/ml)NO(μmol/g pro)對(duì)照組 375.62±10.42＊＊ 283.8±213.12＊＊ 49.31±4.5* 14.44±3.94 14.52±2.20 37.92±22.63＊＊＊ 9.81±0.41＊＊模型組 662.02±121.52 741.77±110.32 47.23±4.31 19.61±2.51 24.97±4.31 28.52±11.31 49.01±25.13聯(lián)苯雙酯 0.15 314.20±121.13＊＊ 384.7±235.21＊＊36.87±3.77* 9.96±2.42* 10.85±3.21＊＊81.74±13.66＊＊＊19.95±0.42＊＊水飛薊素高劑量 0.30 362.23± 124.12＊＊ 492.7±111.80＊＊50.21±2.44* 11.62±2.33* 13.42±4.21＊＊68.72±13.31＊＊ 21.51±1.76＊＊水飛薊素低劑量 0.15 389.21± 102.10＊＊ 476.1±162.31＊＊57.32±2.32* 13.77±2.33＊＊ 14.94±5.25＊＊ 62.21±6.21＊＊ 25.27±1.12＊＊

注:同模型組比較，＊P＞0.05，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

表3 水飛薊素對(duì)TAA小鼠急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究 (+SD)

表3 水飛薊素對(duì)TAA小鼠急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究 (+SD)

注: 同模型組比較，＊P＞0.05，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量(g/kg·d)ALT(IU·L－1)AST(IU·L－1)TP(g·L－1)ALB(g·L－1)MDA(U/nnol)SOD(U/ml)NO(μmol/g pro)對(duì)照組 88.83±3.18＊＊＊＊＊ 97.56±9.45＊＊＊ 60.22±4.77* 28.82±2.44 15.75±4.41＊＊71.26±7.71＊＊＊ 7.88±0.31＊＊模型組 369.73±42.16 251.70±45.34 54.84±2.32 19.49±1.83 30.94±2.18 37.45±4.31 38.83±2.52＊＊＊聯(lián)苯雙酯 0.15 98.12±54.77＊＊＊＊ 142.42±38.22＊＊59.66±3.44* 23.96±2.88＊＊ 13.84±3.48＊＊79.73±7.84＊＊＊ 17.82±1.24＊＊水飛薊素高劑量 0.30 104.31± 43.13＊＊＊ 167.31±34.23＊＊ 58.73±2.43 32.75±5.32＊＊ 18.72±3.74＊＊ 62.42±6.48＊＊ 29.61±1.62＊＊水飛薊素低劑量 0.15 116.52± 43.23＊＊ 176.42±31.42＊＊ 63.51±3.72 35.42±5.62＊＊＊＊19.83±4.34＊＊ 69.94±6.34＊＊ 31.52±1.51＊＊

3.3 水飛薊素對(duì)TAA致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用 正常對(duì)照組的SOD、NO和MDA含量與空白模型組比較差異顯著 (P＜0.01)，說明本實(shí)驗(yàn)水飛薊素對(duì)TAA致急性肝損傷小鼠的造模是成功的。水飛薊素高、低劑量組及聯(lián)苯雙酯組均能明顯降低 TAA急性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST和GLB(P＜0.001)，但TP沒有差異，血清MDA和NO含量的明顯降低，血清的超氧化物歧化酶SOD的活性均升高。結(jié)果見表3。

4 討論

免疫性肝炎與用化學(xué)物質(zhì)造成的肝損傷的動(dòng)物模型比較，在病理機(jī)制上更接近人體的肝炎。陳奇［6］治療肝炎的中藥的藥效學(xué)研究，有各種經(jīng)典的動(dòng)物模型。韓永輝等［7］用CCl4引起肝細(xì)胞損傷時(shí)，破壞了膜的結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞內(nèi)的多種酶可透過肝細(xì)胞膜到肝竇狀隙，進(jìn)入血液，使血中的多種酶活性增高，由于轉(zhuǎn)氨酶是肝細(xì)胞損傷最敏感的指標(biāo)之一。因此，轉(zhuǎn)氨酶升高，在一定程度反映了肝細(xì)胞損害的程度。

促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)、再生水飛薊素進(jìn)入肝細(xì)胞后可與雌二醇受體結(jié)合并使之激活，活化的受體則可增強(qiáng)肝細(xì)胞核內(nèi)RNA聚合酶I的活性，使核糖體RNA轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)核糖體數(shù)目增多，促進(jìn)酶及結(jié)構(gòu)蛋白的合成，并間接促進(jìn)DNA的合成，有利于肝細(xì)胞修復(fù)，再生。這種作用可見于受傷的肝細(xì)胞及肝切除后剩余的肝細(xì)胞，而未見于正常肝細(xì)胞及多種惡性腫瘤細(xì)胞［8］。Ph ilippe等人［11］報(bào)道水飛薊素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用，并討論了作用機(jī)制，指出水飛薊素具有防止CCl4的代謝激活生成的自由基和對(duì)這些自由基有清除作用。水飛薊素能使CCl4對(duì)脂質(zhì)的共價(jià)結(jié)合明顯減少，CCl4所致的脂質(zhì)過氧化被水飛薊素減少72%。水飛薊賓為抗氧自由基活性物質(zhì)，其抗脂質(zhì)過氧化的作用已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)證實(shí)。水飛薊賓具有防止CCl4誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用，即能減少并清除CCl4的代謝激活生成的自由基。還有認(rèn)為水飛薊賓能使CCl4對(duì)脂質(zhì)的共價(jià)結(jié)合明顯減少［12］。水飛薊賓能促進(jìn)細(xì)胞DNA及結(jié)構(gòu)蛋白等的合成，從而促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)和再生。SPC是我室自行合成的水飛薊賓與磷脂酰膽堿的分子型復(fù)合物，具有較好的生物利用度，并且復(fù)合物中所含磷脂酰膽堿也具有抗自由基活性、抗脂質(zhì)過氧化作用［13］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:水飛薊素高、低劑量組有促進(jìn)免疫性肝損傷和急性肝損傷血清ALT、AST恢復(fù)的作用，提示該藥具有穩(wěn)定肝細(xì)胞膜作用，主要的機(jī)制可能是水飛薊素有清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，抑制肝組織MDA的升高，阻止SOD的耗竭，提高SOD的活性，說明水飛薊素對(duì)免疫性肝損傷和急性肝損傷所致小鼠急性肝損傷有明顯的保護(hù)和治療作用，能明顯減輕所致小鼠肝損傷程度。從而避免肝細(xì)胞的損害，起到保護(hù)肝細(xì)胞的作用。我們利用這一模型研究證實(shí)水飛薊素對(duì)免疫性肝炎和急性肝損傷具有很好的拮抗和保肝護(hù)肝的作用。

近年來，由于水飛薊素顯示出保肝和抗氧化以外的活性而備受關(guān)注，其中水飛薊素表現(xiàn)出的抗癌和腫瘤預(yù)防作用已經(jīng)顯示出很好的開發(fā)潛力。它被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品和化妝品等產(chǎn)品中。被稱為“天然的保肝藥”;作為強(qiáng)抗氧化劑，能夠清除人體內(nèi)的自由基，延緩衰老。因此我們?nèi)裟芊e極開發(fā)生物利用度高，臨床療效好的水飛薊素類制劑，對(duì)于開發(fā)新型抗肝病藥物并擴(kuò)大其臨床應(yīng)用范圍具有非常重要的意義。

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The study of Prorection effect of model silmyarin on hepatic injured in mice

HUANG cai－ling1，XIAO liu－ying2，PAN jing－qiang2
1.Department of Pharmacy，Cong Hua Central Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510900，China;2.Guangzhou Hospital Traditional Chinese medicine(Guangzhou institute of traditional Chinese Medicine and Materia Medica)，Guangzhou 510130，China

Objective:To observe the study the effect prorection of model silmyarin on Immunological hepatitis and experimental hepatotoxicity in mice.Mothods:The mouse model of immunological hepatits was established by intravenously injecting of BCG(5×106bacilli/mouse)and after 11 days intravenously injecting of lipopdysaccharide(7.5μg/mouse)and experimental hepatotoxicity mice model induced by Carbon Tetrchloride(CCL4)and Thioacetamide(TAA).The research of effect Prorection of machemism silmyarin on Immuological Hepatitis and experimental hepatotoxicity in mice.Results:The effected of silmyarin significantly decrease the liver of serum ALT、AST in mouse immulogical hepatitis model.The silmyarin could obviously increase the activity by SOD in serum of mice and the content of MDA could obviously decrease of serum.Conlusious:silmyarin could frotect mice from immunological liver injury and experimental hepatotoxicity.

silmyarin;immunological hepatitis;experimental hepatotoxicity

R965.2

A

1007－8517(2012)15－0036－03

2012.05.27)