正交試驗(yàn)優(yōu)選治傷靈顆粒劑的水提醇沉工藝

張世波 曹清遠(yuǎn)

(1 瀘州市中醫(yī)院，四川 瀘州 646000；2 四川瀘州食品藥品檢驗(yàn)所，四川 瀘州 64600）

治傷靈顆粒劑是由某醫(yī)院老中醫(yī)在臨床十多年醫(yī)學(xué)實(shí)踐基礎(chǔ)上，由血府逐瘀方演生而來，該藥主要由桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、生地、骨碎補(bǔ)、赤芍、牛膝、柴胡、枳殼、桔梗、甘草等組成，具有活血化瘀，溫經(jīng)行氣，定痛止血，斂瘡生肌之功效，用于瘀血內(nèi)阻，頭痛胸痛，內(nèi)熱憋悶，跌打損傷，失眠多夢，經(jīng)痛及經(jīng)行不暢等癥。根據(jù)方中各藥味的化學(xué)成分及藥理作用，對(duì)提取純化工藝進(jìn)行優(yōu)選，以保證其療效。

圖1 芍藥苷HPLC色譜圖

1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；AE 200電子天平（Mettler公司）；實(shí)驗(yàn)藥材（成都吉安康藥業(yè)有限公司，經(jīng)成都軍區(qū)總醫(yī)院藥檢室劉永勝鑒定與《中國藥典》2005版一部正品相符。）；芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110736-200731）；95%乙醇；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 芍藥苷含量測定方法學(xué)考查

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（ 4.6 mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇：水（35∶65）；流速：1.0mL/min；紫外檢測波長：λ=230nm[1]；進(jìn)樣量：4μL；柱溫：30℃。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取芍藥苷對(duì)照品10mg，置100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋置刻度，搖勻后作為對(duì)照品溶液（每1mL中含芍藥苷0.1mg）。

2.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取治傷靈干浸膏1g，以甲醇水溶液稀釋至10mL，用微孔濾膜（0. 45μm）濾過，取其續(xù)濾液，制得供試品溶液。

2.1.4 陰性干擾實(shí)驗(yàn)

取處方組成份量，按制備工藝同供試品溶液制備方法制成缺赤芍的陰性供試品溶液，精密進(jìn)樣4μL，結(jié)果在7～10min之間無明顯的峰出現(xiàn)，即無干擾。結(jié)果見圖1。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取上述對(duì)照品溶液2μL、4μL、8μL、10μL、12μL、16μL按上述色譜條件測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程：Y = 1449.9x+8.2337（R =0.9999）。結(jié)果表明芍藥苷進(jìn)樣量在為0.2～1.6μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.1.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測得其峰面積的RSD%= 0.766，表明精密度良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的同一批樣品9份，向每份樣品中精密加入適量的對(duì)照品（0.1mg/mL）溶液，按供試品溶液的制備項(xiàng)下操作，再按色譜條件項(xiàng)下的色譜條件測定，測得芍藥苷平均回收率為99.76%，RSD%=0.64，結(jié)果見表1。

2.1.8 樣品中芍藥苷含量測定

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

將標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件分別精密進(jìn)樣4μL，測定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或外標(biāo)法求得各供試品溶液中芍藥苷的含量。

2.2 正交試驗(yàn)與結(jié)果

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，選擇影響提取效果的主要因素：加水倍數(shù)（A）、提取時(shí)間（B）、煎煮次數(shù)（C）、醇沉濃度（D）作為考察對(duì)象，每個(gè)因素?cái)M定3個(gè)水平（見表2），進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)[2]。以芍藥苷含量和干膏率的綜合評(píng)價(jià)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出最佳提取純化工藝[4]。正交設(shè)計(jì)因素水平表見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4、表5。

表2 正交設(shè)計(jì)因素水平表

由表3進(jìn)行直觀分析，按芍藥苷含量為0.6，干膏率為0.4的權(quán)重系數(shù)綜合分析可知，治傷靈顆粒劑的水提工藝條件以A2B1C2D3為佳，即加8倍量水煎煮2次，每次1 h，醇沉濃度70%，同時(shí)由表3可得，影響水提效果的主要因素是醇沉濃度和煎煮次數(shù)，其次是加水量，因提取時(shí)間影響最小，故可用其為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析[5]。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按優(yōu)選的工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得芍藥苷的含量分別為2.21、2.18、2.23 mg/g，RSD為1.14%，干膏率分別15.95、16.01、15.88%，RSD為0.41%。測得值基本優(yōu)于正交表中的試驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為驗(yàn)證結(jié)果較為滿意，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3 討 論

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的計(jì)算結(jié)果表

赤芍為方中主藥之一，主要含芍藥苷，藥理研究證明具有清熱涼血，散瘀止痛的作用。用高效液相色譜法來測定其含量，干擾較小、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、操作簡便。故本試驗(yàn)采用芍藥苷含量和干膏出膏率作為正交試驗(yàn)的考核指標(biāo)[1-4]。

本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方法對(duì)治傷靈顆粒劑的提取純化工藝進(jìn)行優(yōu)化篩選，確認(rèn)治傷靈顆粒劑的水提醇沉最佳工藝條件為：加8倍量水，煎煮2次，每次1h，醇沉濃度70%。確定的提取工藝科學(xué)，可行，為以后該制劑的制備工藝提供依據(jù)。

表4 芍藥苷含量方差分析表

表5 干膏率方差分析表

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