烏梅水煎物對實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的作用

何愛明，王乙林，林世明(.福建師范大學(xué)福清分校生物與化學(xué)工程系，福建福清350300;.福建省福清衛(wèi)生學(xué)校藥理教研組 ，福建 福清350300)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)又稱為非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，是炎癥性腸病的一種，是臨床常見的一種消化道疾病，嚴(yán)重影響人類的健康，本病病變主要限于黏膜及黏膜下層，呈連續(xù)性非節(jié)段性分布，多累及直腸、乙狀結(jié)腸、左半結(jié)腸。臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液樣血便、或有便秘、腹脹等消化道癥狀，常反復(fù)發(fā)作、纏綿難愈。其病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確。近年來自由基在UC發(fā)病機(jī)制中的作用已成為研究的重要課題。研究提示，UC的發(fā)生、發(fā)展與氧自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化有關(guān)［1］。

多年來，許多學(xué)者探索應(yīng)用中醫(yī)藥治療UC，烏梅丸被廣泛運(yùn)用于UC的臨床治療［2～4］，收到很肯定的療效，但均未究其作用機(jī)制。烏梅(Fructus Mume)是由薔薇科植物梅(Prunus mume Sieb.et Zucc.)的干燥近成熟果實(shí)加工而成。烏梅始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品?！吨袊幍?2010年版一部收載的“烏梅”正品有烏梅、烏梅肉和烏梅炭3種，其性味歸經(jīng)皆為酸、澀，平。歸肝、脾、肺、大腸經(jīng)。其功能主治為斂肺，澀腸，生津，安蛔。用于肺虛久咳，久痢滑腸，虛熱消渴，蛔厥嘔吐腹痛;膽道蛔蟲癥。

本文通過測定過氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醇(MDA)含量水平的變化，進(jìn)行探討烏梅對化學(xué)試劑誘導(dǎo)的小鼠UC的作用及作用機(jī)制，以期為今后進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥品 SOD、MDA試劑盒購于南京建成生物工程公司。其余試劑均為分析純。

烏梅購于宜又佳連鎖藥店，由云南白藥集團(tuán)天紫紅藥業(yè)有限公司昆明中藥飲片廠生產(chǎn)，取烏梅(去核)加6倍量水，加熱煮沸30 min，雙層紗布過濾，濾渣再加同樣量水，加熱煮沸30 min，雙層紗布過濾，合并濾液于水浴加熱濃縮至所需濃度備用［5］。《中國藥典》2005年版一部規(guī)定人用劑量為6～12 g/d，因藥材水煮濃縮后制備出來的供試液極其黏稠，故高劑量組的給藥濃度設(shè)定為0.4 g/ml、10 ml/kg。小鼠低、中、高劑量按成人最大劑量的 5、10、15 倍給藥，即 2、4、6 g 生藥/(kg·d)。葡聚糖硫酸鈉(DSS)為上海前塵生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器 恒溫水浴箱為江蘇省太倉醫(yī)療器械廠產(chǎn)品，低溫離心機(jī)為珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物 健康昆明種小鼠，SPF級(jí)，雄性，體重為(20±2)g，90只。由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):閩實(shí)動(dòng)質(zhì)準(zhǔn)第00205號(hào)。

2 方法

2.1 造模方法 動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重大小隨機(jī)分為正常組、模型組、烏梅低、中、高劑量組5組，每組15只。動(dòng)物禁食不禁水24 h，留取正常組15只動(dòng)物，其余60只小鼠再參照文獻(xiàn)報(bào)道［6］，用 3%DSS(分子量 500 000)溶液給小鼠自由飲水，連續(xù)7 d。造模期間每天觀察小鼠性狀、飲食、毛發(fā)、活潑狀態(tài)等。模型建立成功的標(biāo)志為飲用3%DSS后出現(xiàn)稀便、腹瀉、大便隱血(+)或肉眼血便的任一癥狀。選取造模成功的小鼠隨機(jī)分入各組。

2.2 給藥與標(biāo)本處理方法 造模成功后，即造模第8天開始灌胃，正常組、模型組分別給予0.33 ml生理鹽水灌胃，烏梅低、中、高劑量組分別按設(shè)計(jì)劑量給藥。每天一次，均連續(xù)給藥10 d，期間除正常組小鼠自由飲用生理鹽水，其他各組小鼠自由飲用3%DSS水溶液，并且每天定時(shí)稱量小鼠體重，進(jìn)行隱血試驗(yàn)和觀察糞便性狀。分別在試驗(yàn)第5天、第10天，將小鼠稱重，并放入代謝籠中，收集小鼠大便，記錄大便性狀，且取部分糞便測定隱血。進(jìn)行疾病活動(dòng)度(DAI)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。DAI=體重下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+隱血分?jǐn)?shù)。

表1 疾病活動(dòng)度評(píng)分

2.3 組織形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)與方法 給藥結(jié)束后脫頸處死小鼠，剪開腹腔，取全段結(jié)腸，剪開，生理鹽水洗干凈，平鋪于白板上置于放大鏡下肉眼觀察結(jié)腸大體形態(tài)、結(jié)腸黏膜損傷情況;將固定的結(jié)腸組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化。按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［7］進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)評(píng)分。

2.4 SOD、MDA的測定 取炎癥改變最明顯處的結(jié)腸粘膜組織，濕重200 mg，用4℃冰生理鹽水洗凈，除去血污，濾紙吸干，稱重用勻漿器在冰浴條件下制成勻漿，低溫離心機(jī)4 000 r/min離心15 min，取適量上清液分裝于EP管，-20℃保存，按試劑盒說明操作檢測SOD活力及MDA含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用(±s)表示，組間差異采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，方差齊時(shí)用 Scheffe法，方差不齊時(shí)用Games-Howell法。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況的影響 試驗(yàn)后第5～6天，造模小鼠出現(xiàn)腹瀉、飲食減少、體毛無光澤、第6～7天出現(xiàn)不同程度的肉眼血便，蜷縮，活動(dòng)減少，體重減輕。經(jīng)供試品治療7 d后，烏梅中、高劑量組無肉眼血便，可見松散大便。正常對照組小鼠一般性狀無明顯改變。

3.2 小鼠的疾病活動(dòng)度評(píng)分 試驗(yàn)結(jié)果顯示，烏梅低、中、高劑量組的DAI均降低，其中低劑量組與模型組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，中、高劑量組與模型組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，低劑量組與正常組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，中劑量組與正常組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，高劑量組與正常組比較無顯著性差異。評(píng)分結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠的疾病活動(dòng)度評(píng)分(±s)

表2 各組小鼠的疾病活動(dòng)度評(píng)分(±s)

1)P ﹤0.05，2)P ﹤0.01，與模型組比較;3)P ＜0.05，4)P ＜0.01，與正常組比較。

組別 數(shù)量 劑量［g/(kg·d)］評(píng)分正常組15 0 0模型組 15 0 10.16±0.36低劑量組 15 2 7.86±0.211)4)中劑量組 15 4 3.35±0.242)3)高劑量組 15 6 2.16±0.172)

3.3 小鼠結(jié)腸黏膜損傷與評(píng)分 肉眼及光鏡下觀察模型組黏膜糜爛重，潰瘍多而且大，黏膜嚴(yán)重充血、水腫;烏梅高劑量組黏膜糜爛不嚴(yán)重，潰瘍小，黏膜充血、水腫程度輕;烏梅低劑量組黏膜糜爛較嚴(yán)重，潰瘍?nèi)暂^明顯，黏膜充血、水腫程度亦可見及，無明顯減輕;烏梅中劑量組的組織損傷介于高劑量組和低劑量組之間。正常組動(dòng)物未見及黏膜充血、水腫和糜爛，黏膜光滑平整。評(píng)分結(jié)果見表3。

表3 肉眼及光鏡下觀察各組小鼠結(jié)腸黏膜損傷與評(píng)分的比較(±s)

表3 肉眼及光鏡下觀察各組小鼠結(jié)腸黏膜損傷與評(píng)分的比較(±s)

1)P ﹤0.05，2)P ﹤0.01，與模型組比較;3)P ＜0.01，與正常組比較。

組別 數(shù)量 劑量 肉眼評(píng)分 光鏡下評(píng)分［g/(kg·d)］正常組15 0 0 0模型組 15 0 7.98±0.29 4.23±0.24低劑量組 15 2 5.98±0.231)3) 4.13±0.263)中劑量組 15 4 4.51±0.232)3) 2.19±0.211)3)高劑量組 15 6 1.16±0.242) 1.18±0.122)

3.4 小鼠結(jié)腸組織SOD活力與MAD含量 試驗(yàn)結(jié)果顯示，烏梅低、中、高劑量組的SOD活力值雖均低于正常組，但均高于模型組，其中低劑量組與模型組比較無顯著性差異，中、高劑量組與模型組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，低劑量組與正常組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，中劑量組與正常組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，高劑量組與正常組比較無顯著性差異，結(jié)果見表4。測得MDA含量中，烏梅低、中、高劑量組雖均高于正常組但均低于模型組，其中低劑量組與模型組比較無顯著性差異，中、高劑量組與模型組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，低劑量組與正常組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，中、高劑量組與正常組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠結(jié)腸組織SOD活力與MAD含量的改變(±s)

表4 各組小鼠結(jié)腸組織SOD活力與MAD含量的改變(±s)

1)P ﹤0.01，模型組比較;2)P ﹤0.05，3)P ＜0.01，與正常組比較。

組別 數(shù)量 劑量SOD(U/g) MDA(nmol/g)［g/(kg·d)］正常組15 0 22.65±2.21 8.42±1.52模型組 15 0 11.03±1.95 36.75±2.02低劑量組 15 2 12.25±1.583) 31.16±2.612)中劑量組 15 4 18.28±1.591)2)15.84±1.631)2)高劑量組 15 6 19.32±1.881) 16.25±1.481)2)

4 討論

DSS誘導(dǎo)的UC是一個(gè)重要模型，DSS破壞腸黏膜屏障，使粘膜組織凝固壞死，增加DSS的通透性，促進(jìn)DSS在結(jié)腸中擴(kuò)散，加重炎癥反應(yīng)［8］。該模型具有操作簡單、重現(xiàn)性好、造型時(shí)間短等特點(diǎn)。因此比較適合該類藥物的研究與篩選。潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的一種，IBD已被公認(rèn)為是胃腸道中除惡變外最嚴(yán)重的疾病之一，流行病學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展與結(jié)腸炎癥的反復(fù)發(fā)作密切相關(guān)，目前UC的病因與發(fā)病機(jī)制并不十分清楚。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥介質(zhì)(白三烯、前列腺素等)在UC炎癥反應(yīng)中作用倍受重視，氧自由基(OFR)參與并且通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生這些物質(zhì)。OFR在UC的發(fā)病中起重要作用，細(xì)胞中的脂類物質(zhì)受到OFR作用時(shí)，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生一些分解產(chǎn)物，如MDA等。MDA為脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物，其含量反映了組織中過氧化損傷程度。SOD是重要的過氧化物歧化酶，能有效地清除氧自由基，從而抑制腸組織中的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并能穩(wěn)定細(xì)胞膜。SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MAD的高低又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本研究中，模型組小鼠的DAI評(píng)分和大體形態(tài)以及組織學(xué)評(píng)分均明顯高于正常組，模型組小鼠結(jié)腸中SOD活性顯著低于正常組。模型組小鼠結(jié)腸中MDA含量顯著高于正常組，這些反映了氧化應(yīng)激過程。尤其是氧自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化與潰瘍性結(jié)腸炎有關(guān)［9］，可能是其發(fā)病機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，自由基與UC的結(jié)腸組織損傷密切相關(guān)，參考UC的病理過程，用烏梅治療后UC組織中的MDA含量降低，SOD活性提高，疾病活動(dòng)度降低，組織病理改變明顯減輕，說明UC發(fā)病的自由基學(xué)說為減少M(fèi)DA含量以及抗氧化治療提供了理論依據(jù)，降低自由基水平可以為治療潰瘍性結(jié)腸炎提供新的途徑。

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