扶正敗毒顆粒對(duì)膿毒癥大鼠腹腔感染所致腸損傷的保護(hù)作用

王丁超，高 翔，蘇秀平，王 靜，吳桂玲，張 韌，陳曉敏

(1.濮陽(yáng)市中醫(yī)院，河南 濮陽(yáng)457003;2.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州450002)

嚴(yán)重的腹腔感染可以引起腸道的損傷，出現(xiàn)腸麻痹、腸道內(nèi)毒素淤滯、腸屏障破壞、腸道內(nèi)菌群失調(diào)以及腸道細(xì)菌移位，引起代謝紊亂、免疫功能障礙以及內(nèi)環(huán)境平衡破壞和腸源性感染，腸損傷在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起到推波助瀾的作用［1－2］。扶正敗毒顆粒為濮陽(yáng)市中醫(yī)院院內(nèi)制劑，由人參、生大黃、水牛角、生地黃、麥冬、玄參、石膏、知母、黃連、冰片等組成，具有解毒降濁、益氣化瘀功能，可以蕩滌胃腸積滯，抗菌排毒，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，保護(hù)腸屏障，改善腸道的缺血再灌注損傷，減少腸損傷帶來(lái)的腸源性內(nèi)毒素血癥，下調(diào)炎性介質(zhì)，保護(hù)靶器官。本實(shí)驗(yàn)以膿毒癥大鼠為研究對(duì)象，觀察大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比率、腸組織含水量、腸組織白細(xì)胞介素－ 1(IL-1)、腫瘤壞死因子－ α(TNF-α)表達(dá)變化，探討中藥復(fù)方扶正敗毒顆粒對(duì)膿毒癥大鼠腹腔感染所致腸損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

青年SD 大鼠154 只，清潔級(jí)，雌雄各半，鼠齡3～4月，體質(zhì)量(300 ±50)g，由河南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(豫)2009－0006。

1.2 藥品、試劑與儀器

扶正敗毒顆粒，由濮陽(yáng)市中醫(yī)院中藥制劑室提供，批號(hào)20090605;烏司他丁，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)S19990050。IL-1 單克隆抗體(批號(hào)BA0131，BA0962)及TNF-α 單克隆抗體(批號(hào)BA0990，BA0544)，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。PM－10AD 型光學(xué)顯微鏡，Olympus Optical Co.LTD 產(chǎn)品;JA1203 型電子天平，上海精科天平廠產(chǎn)品;XS－ 800i 型自動(dòng)血液分析儀，日本希森美康公司產(chǎn)品。

1.3 分組與模型的建立

將SD 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組、扶正敗毒顆粒組、烏司他丁組及扶正敗毒顆粒聯(lián)合烏司他丁聯(lián)合組(以下簡(jiǎn)稱聯(lián)合組)，每組36 只，另設(shè)假手術(shù)組10 只。參考文獻(xiàn)［3－4］加以改良建立膿毒癥動(dòng)物模型。以水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠;待完全麻醉后，仰臥位固定大鼠，頸部皮膚常規(guī)備皮、消毒;于頸外側(cè)下頜至心臟的中點(diǎn)作1 個(gè)約1 cm 的橫切口，鈍性分離皮下組織，暴露右側(cè)頸外靜脈;沿血管向近心端方向插入留置針約1 cm，將導(dǎo)管從留置針管與頸外靜脈夾孔中把心導(dǎo)管慢慢置入達(dá)右心房，結(jié)扎固定，導(dǎo)管末端經(jīng)皮下隧道從頸后中央引出并固定于皮膚;管內(nèi)注射125 U/mL 肝素0.5 mL 抗凝，插入置管針封閉導(dǎo)管;然后沿腹白線中段作3 cm切口，探查取出盲腸;用四號(hào)絲線距盲端1 cm 處結(jié)扎，用12 號(hào)針穿刺3 個(gè)孔，擠出少許糞便于腹腔內(nèi)，回納盲腸，分層縫合腹腔。假手術(shù)組僅在頸部及腹部各做1 個(gè)切口，縫合。手術(shù)過(guò)程中保持大鼠肛溫(37.0 ±0.5)℃，保持室溫(26 ±1)℃。

1.4 給藥方法

造模后第1 日，假手術(shù)組、模型對(duì)照組、烏司他丁組用生理鹽水灌胃，扶正敗毒顆粒組、聯(lián)合組用扶正敗毒顆粒(36. 8 mg/100 g)灌胃(灌胃容積為1 mL/100 g)，每日灌胃1 次，連續(xù)7 d，直至取材;此外，烏司他丁組、聯(lián)合組大鼠分別于造模后第1 天腹腔內(nèi)注射烏司他丁(1 萬(wàn)U/kg)，假手術(shù)組、模型對(duì)照組、扶正敗毒顆粒組用同等容積的生理鹽水腹腔注射，每天1 次，連續(xù)7 d，直至取材。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 外周血白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比率

在造模結(jié)束后第2，3，7 d 取材。取大鼠尾部靜脈血，用XS-800i 自動(dòng)血液分析儀自動(dòng)分析計(jì)數(shù)外周血白細(xì)胞(×109L－1)和中性粒細(xì)胞比率(%)。

1.5.2 腸組織含水量

稱取腸組織濕質(zhì)量，然后放入恒溫箱(100 ±2 ℃)干燥，24 h 后取出，稱取干質(zhì)量，計(jì)算腸組織含水量。計(jì)算公式:腸組織含水量=(腸濕質(zhì)量－腸干質(zhì)量)/腸濕質(zhì)量×100%，以%表示。

1.5.3 腸組織TNF-α、IL-1 表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)SP 法檢測(cè)。在400 倍光鏡下觀察，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿呈棕色為免疫組化陽(yáng)性。用Image－Pro Plus 5.1 專業(yè)圖像采集與分析系統(tǒng)采集圖像，并進(jìn)行半定量分析。每張切片隨機(jī)選取不重疊的5 個(gè)視野拍照，測(cè)定其平均吸光度(A)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值代表各細(xì)胞因子的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)()±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組內(nèi)差異比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 扶正敗毒顆粒對(duì)膿毒癥大鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比率的影響

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)大鼠外周血WBC 計(jì)數(shù)升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，扶正敗毒顆粒組、烏司他丁組及聯(lián)合組各時(shí)間點(diǎn)白細(xì)胞計(jì)數(shù)均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。各藥物組7 d時(shí)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)均較2 d、3 d 時(shí)下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，以聯(lián)合7 d 組下降尤為顯著。外周血中性粒細(xì)胞比率變化與白細(xì)胞計(jì)數(shù)變化呈正相關(guān)。見表1。

表1 各組大鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比率對(duì)比 ±s

表1 各組大鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比率對(duì)比 ±s

注:與假手術(shù)組比較，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比，# P＜0.05，## P＜0.01;與扶正敗毒顆粒組對(duì)比，△P＜0.05，△△P＜0.01;與2 d 組對(duì)比，＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與3 d 組對(duì)比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組 別 取材時(shí)間點(diǎn) 動(dòng)物數(shù) 白細(xì)胞計(jì)數(shù)/(×109 L －1) 中性粒細(xì)胞比率/%假手術(shù)組6 4.38 ±0.88 62.16 ±0.00造模結(jié)束第2 d 6 12.07 ±1.27＊＊ 80.53 ±1.70＊＊3 d 6 15.88 ±1.78＊＊ 91.70 ±2.46＊＊7 d 6 14.58 ±1.57＊＊ 85.24 ±2.04＊＊▲造模結(jié)束第2 d 6 8.87 ±0.92 76.18 ±1.37 3 d 6 10.60 ±1.29## 82.35 ±1.69##7 d 6 9.17 ±1.25##＊＊▲▲ 73.21 ±2.26##＊＊▲▲造模結(jié)束第2 d 6 8.25 ±0.77 77.06 ±1.60 3 d 6 9.33 ±1.11 80.39 ±1.45 7 d 6 6.75 ±1.76#△△＊＊▲▲ 72.86 ±2.27#△△＊＊▲▲造模結(jié)束第2 d 6 7.07 ±1.70 74.11 ±1.22#3 d 6 5.63 ±1.36## 70.26 ±1.94##7 d 6 ##△＊＊▲▲ ##△＊＊▲▲模型對(duì)照組 扶正敗毒顆粒組 烏司他丁組 聯(lián)合組 4.98 ±0.9865.37 ±1.79

2.2 扶正敗毒顆粒對(duì)膿毒癥大鼠腸組織含水量的影響

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)大鼠腸組織含水量升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)比，各藥物組各時(shí)間點(diǎn)的大鼠腸組織含水量均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。各藥物組7 d 時(shí)的含水量均較2 d、3 d 時(shí)下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，以聯(lián)合7 d 組下降尤為顯著。見表2。

表2 各組大鼠腸組織含水量對(duì)比 ±s

表2 各組大鼠腸組織含水量對(duì)比 ±s

注:與假手術(shù)組對(duì)比，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比，# P＜0.05，## P＜0.01;與扶正敗毒顆粒組對(duì)比，△P＜0.05，△△P＜0.01;與2 d 組對(duì)比，＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與3 d 組對(duì)比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

/%假手術(shù)組組 別 取材時(shí)間點(diǎn) 動(dòng)物數(shù) 含水量6 72.72 ±1.39模型對(duì)照組 造模結(jié)束第2 d 6 83.22 ±1.30＊＊3 d 6 87.41 ±1.05＊＊＊7 d 6 85.64 ±1.35＊＊結(jié)束第2 d 6 81.17 ±1.49 3 d 6 82.58 ±0.82 7 d 6 80.72 ±1.30##＊＊▲▲結(jié)束第2 d 6 80.39 ±1.44 3 d 6 83.29 ±1.51#＊7 d 6 80.10 ±1.15#＊＊▲▲結(jié)束第2 d 6 79.28 ±1.77#3 d 6 81.45 ±1.26##7 d 6 78.64±1.22##△＊＊▲▲扶正敗毒顆粒組 造模烏司他丁組 造模聯(lián)合組 造模

2.3 扶正敗毒顆粒對(duì)膿毒癥大鼠腸組織TNF-α、IL-1 表達(dá)的影響

假手術(shù)組腸組織少量TNF-α、IL-1 陽(yáng)性表達(dá)。模型對(duì)照組2 d、3 d 和7d 時(shí)的腸組織TNF-α、IL-1表達(dá)均較假手術(shù)組增強(qiáng)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，扶正敗毒顆粒組、烏司他丁組的3d、7d 及聯(lián)合組各時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-1 的表達(dá)均減弱，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。各藥物組3 d 時(shí)的表達(dá)均較2 d 時(shí)減弱，7 d 時(shí)的表達(dá)均較3 d 時(shí)顯著減弱，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，以聯(lián)合7 d 組尤為顯著。見表3。

表3 各組大鼠腸組織TNF-α、IL-1 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)對(duì)比 IOD，光密度單位，±s

表3 各組大鼠腸組織TNF-α、IL-1 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)對(duì)比 IOD，光密度單位，±s

注:與假手術(shù)組對(duì)比，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比，# P＜0.05，## P＜0.01;與扶正敗毒顆粒組對(duì)比，△P＜0.05，△△P＜0.01;與2 d 組對(duì)比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01;與3 d 組對(duì)比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組 別 取材時(shí)間點(diǎn) 動(dòng)物數(shù) 腸組織TNF-α 腸組織IL-1假手術(shù)組6 2.89 ±1.07 2.19 ±1.62模結(jié)束第2 d 6 19.66 ±1.12 19.38 ±1.26 3 d 6 12.59 ±2.3* 12.37 ±1.22＊＊7 d 6 10.13 ±1.08＊＊▲ 10.38 ±2.38＊＊＊▲模結(jié)束第3 2 dd 6 6 12 9..7 6 7 8±±1 1..1 52 4####1 1 3 0..2 7 3 2±±2 2..9 3 5 1#7 d 6 8.01 ±2.27##＊＊▲ 8.33 ±1.58#＊▲模結(jié)束第2 d 6 14.23 ±2.53# 15.63 ±2.63#3 d 6 10.93 ±1.46# 10.29 ±2.99＊7 d 6 9.56 ±1.41##＊▲ 9.11 ±1.46＊＊▲模結(jié)束第2 d 6 7.49 ±1.77## 9.22 ±1.13##3 d 6 6.93 ±1.88## 8.16 ±2.24##△7 d 6 5.88 ±1.66##△△＊＊▲▲ 6.24 ±2.32##△△＊＊▲▲模型對(duì)照組 造扶正敗毒顆粒組 造烏司他丁組 造聯(lián)合組 造

3 討 論

膿毒癥屬中醫(yī)學(xué)“傷寒”、“溫病”的范疇，由于邪毒入侵(如嚴(yán)重感染、中毒、休克等)或各種創(chuàng)傷(如外傷、燒傷、燙傷、手術(shù)等)導(dǎo)致正邪交爭(zhēng)、正氣耗傷、邪毒阻滯而發(fā)病。正氣虧虛、濁毒內(nèi)蘊(yùn)、絡(luò)脈瘀滯是膿毒癥的主要病機(jī)之一。正氣不足、毒邪內(nèi)蘊(yùn)陷于營(yíng)血，使絡(luò)脈氣血營(yíng)衛(wèi)運(yùn)行不暢，而致毒熱、瘀血、濁毒瘀滯絡(luò)脈，進(jìn)而使各臟器受邪而損傷，引發(fā)本病。本病的病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以氣虛為主勢(shì)以緩，標(biāo)實(shí)則以濁毒(熱毒、瘀毒、濁毒)為主勢(shì)以急，虛、瘀、毒交互影響，形成惡性循環(huán)。故治療宜以清熱解毒、降濁化瘀為主，兼顧益氣扶正。解毒降濁，導(dǎo)毒邪下行，使熱清、瘀化、濁去，從而使邪去正安，機(jī)體陰陽(yáng)平衡狀態(tài)得以恢復(fù)。扶正敗毒顆粒由人參、生大黃、水牛角、生地黃、麥冬、玄參、石膏、知母、黃連、冰片等組成。方中大黃既可解毒降濁以釜底抽薪，又可化瘀通絡(luò)，為君藥。人參扶正大補(bǔ)元?dú)獠⒎来簏S攻下之峻烈，水牛角清解營(yíng)分之熱毒，寒而不遏，且能散瘀，二者共為臣藥。石膏配知母取白虎義，有清熱保津之功;水牛角配生地黃清熱涼血、活血散瘀，以防血與熱結(jié);黃連苦寒，清熱解毒，以治氣營(yíng)兩燔、氣血兩燔之證;麥冬、生地黃、玄參滋養(yǎng)陰液是為熱甚傷陰而設(shè);以上共為佐使藥。諸藥配伍，共奏解毒降濁、益氣化瘀之功效。本研究顯示，經(jīng)過(guò)扶正敗毒顆粒治療，膿毒癥大鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞比例降低，提示扶正敗毒顆粒對(duì)膿毒癥大鼠具有明顯的抗炎作用。

IL-1 能夠引起多種炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，TNF-α 是全身炎癥反應(yīng)早期的重要炎性細(xì)胞因子，其大量釋放則對(duì)機(jī)體造成損傷，二者協(xié)同可促進(jìn)血管內(nèi)皮、白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，趨化中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞進(jìn)入腸道病變部位，增加血管內(nèi)皮通透性，加重多器官損傷［5－6］。因此，可以通過(guò)抑制IL-1、TNF-α 的釋放而減少全身的炎癥反應(yīng)和多臟器損害，從而對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥大鼠腸組織IL-1、TNF-α 的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均光密度均增高明顯，表明IL-1、TNF-α 參與了膿毒癥的病理?yè)p傷過(guò)程，可能在膿毒癥大鼠的病理生理中占有重要地位。扶正敗毒顆粒、烏司他丁及聯(lián)合用藥后明顯降低了IL-1、TNF-α 在腸組織的表達(dá)，聯(lián)合組效果尤為顯著，這可能與扶正敗毒顆粒、烏司他丁通過(guò)對(duì)機(jī)體內(nèi)毒素的清除，降低細(xì)胞因子IL-1、TNF 的產(chǎn)生，抑制和減少炎性因子的合成和釋放，使其無(wú)法相互協(xié)同促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而能夠改善腸組織損傷。

綜上所述，促炎因子TNF-α 及IL-1 在腹腔感染所致腸損傷中發(fā)揮了重要作用。扶正敗毒顆粒能夠降低外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞比率，降低臟器組織中TNF-α、IL-1 表達(dá)水平以減輕臟器損傷，減輕了腸組織的含水量，對(duì)膿毒癥大鼠具有確切的治療作用。此為扶正敗毒顆粒防治膿毒癥性多器官功能障礙綜合征提供了參考。另外，此對(duì)探討中西醫(yī)結(jié)合治療膿毒癥的干預(yù)策略具有重要意義。

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