拌種靈丙氨酸衍生物的合成及其對(duì)大豆細(xì)胞穿透行為研究

趙 陽，胡 奎，李俊凱，方祖凱，杜鐵鋼(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州434025)

拌種靈丙氨酸衍生物的合成及其對(duì)大豆細(xì)胞穿透行為研究

趙 陽，胡 奎，李俊凱，方祖凱，杜鐵鋼(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州434025)

通過將拌種靈與丙氨酸拼接，合成了拌種靈丙氨酸衍生物，利用核磁共振氫譜和質(zhì)譜進(jìn)行了表征。以拌種靈為對(duì)照藥劑，檢測了該衍生物對(duì)水稻紋枯病的室內(nèi)活性，以及懸浮培養(yǎng)條件下大豆細(xì)胞對(duì)拌種靈丙氨酸衍生物的吸收行為。結(jié)果表明，拌種靈及其丙氨酸衍生物對(duì)水稻紋枯病菌的EC50分別為(2.91±1.39)mg/L和(8.05±1.25)mg/L；在20mg/L的該藥劑培養(yǎng)液中培養(yǎng)2h后，利用HPLC法檢測大豆細(xì)胞內(nèi)拌種靈丙氨酸衍生物含量為30.56mg/kg(FW)，而相同條件下拌種靈在大豆細(xì)胞中含量僅為4.96mg/kg(FW)?？梢?，拌種靈氨基酸衍生物殺菌活性下降，但對(duì)大豆細(xì)胞的穿透能力顯著增強(qiáng)。說明丙氨酸官能團(tuán)能引導(dǎo)該衍生物通過主動(dòng)吸收的方式進(jìn)入植物細(xì)胞。

拌種靈丙氨酸衍生物；合成；大豆細(xì)胞；穿透

內(nèi)吸性殺菌劑由于能滲透到植物體內(nèi)并可傳導(dǎo)至施藥部位，自20世紀(jì)60年代應(yīng)用于防治植物病害以來，使得植物病害化學(xué)防治的面貌大為改觀，已經(jīng)成為植物病害化學(xué)防治的主力軍[1]。但由于大多數(shù)內(nèi)吸性殺菌劑只有向頂性傳導(dǎo)，不能有效地從上向下傳導(dǎo)或者傳導(dǎo)作用微弱，使得根部不能達(dá)到有效的防治濃度，因此采用葉面噴霧控制植物根部或微管束病害以及土傳病害達(dá)不到防病的效果。長期以來，人們一直尋求能通過噴霧防治植物根部病害的藥劑，特別是能雙向傳導(dǎo)的藥劑[2]。

導(dǎo)向農(nóng)藥是農(nóng)藥的有效成分在導(dǎo)向基團(tuán)引導(dǎo)下能向植物特定部位傳導(dǎo)積累的農(nóng)藥[3]。作為導(dǎo)向基團(tuán)，必須具備能引導(dǎo)整個(gè)分子進(jìn)入植物體并向特定部位傳導(dǎo)的功能。氨基酸在植物的生命活動(dòng)中，具有重要的地位，并且在植株體內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)主要在韌皮部內(nèi)進(jìn)行[4]，這個(gè)過程需要質(zhì)膜上特定的載體來完成，設(shè)想如果將氨基酸和高效殺菌劑進(jìn)行結(jié)合，在不屏蔽各自功能結(jié)合位點(diǎn)的前提下，有望得到能被氨基酸載體轉(zhuǎn)運(yùn)的新的化合物分子[5]。Chollet等[6]采用藕合的方法從天門冬氨酸、谷氨酸和賴氨酸出發(fā)，合成了一系列α-氨基酸的衍生物，并試驗(yàn)了賴氨酸-2,4-D對(duì)蠶豆離體葉片從溶液中吸收葡萄糖、蔗糖和蘇氨酸的影響，發(fā)現(xiàn)這種影響非常顯著[7]，同時(shí)該化合物在葉片中的吸收也明顯增加[8]；利用蠶豆植株進(jìn)行的生物活性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該化合物具有與2,4-D同樣的生物活性；通過在8葉期的蓖麻植株上的傳導(dǎo)試驗(yàn)證明，當(dāng)施用在植株的第4、5片葉上后，在植株上下各部位都能檢測到這種化合物的存在，并且在臨近的葉片和旺盛的生長點(diǎn)的含量高于對(duì)照所使用的賴氨酸和2,4-D的含量，由此提出了假設(shè)，可能賴氨酸-2,4-D能在載體的介導(dǎo)下在植株的韌皮部移動(dòng)[9]。

本研究從導(dǎo)向農(nóng)藥的角度，將丙氨酸與拌種靈通過拼接合成，并試驗(yàn)了懸浮培養(yǎng)條件下大豆細(xì)胞對(duì)新化合物的吸收，為進(jìn)一步篩選能在韌皮部傳導(dǎo)的殺菌劑奠定基礎(chǔ)，并為構(gòu)建能在韌皮部傳導(dǎo)的新型殺菌劑的開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

(1)供試植物及處理 將大豆(Glycinemax(L.) Merrill)種子進(jìn)行無毒處理后在固體培養(yǎng)基上無菌萌發(fā)。從1周齡的無菌實(shí)生苗取莖尖頂端大約3～5mm的部分直接用作外植體。按照成雄鷹[10]的方法，誘導(dǎo)用基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，愈傷組織形成后，轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基中在恒溫?fù)u床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速為121r/min。培養(yǎng)15d進(jìn)行繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)8d后供試驗(yàn)用。

(2)供試植物病原菌 供試菌種水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院植物病理系提供。

(3)主要試劑 丙氨酸：上海生化試劑公司生產(chǎn)；97%(w/w)的拌種靈原粉：江蘇南通江山農(nóng)藥化工股份公司提供；95%(w/w)的氯代甲酸芐酯：江蘇省新沂市匯力精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)；40%(w/w)HBr的冰醋酸溶液：湖北省南漳縣襄九精細(xì)化工有限責(zé)任公司；醋酸鋅、多聚甲醛、對(duì)甲苯磺酸、氯化亞砜等試劑均為市售分析純。

(4)主要儀器 6ml的C18反相鍵合固定相SPE柱;LABOROTA 4001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國博勵(lì)行公司);Bruker 400型核磁共振儀(瑞士布魯克公司);Agilent 1100 HPLC-MS儀(美國安捷倫公司);WRR熔點(diǎn)測定儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

(1)拌種靈丙氨酸衍生物的合成 拌種靈丙氨酸衍生物合成路線如圖1所示。在500ml圓底燒瓶中，將15g L-丙氨酸溶于200ml 2mol/L的NaHCO3溶液中，0～10℃下加入35g氯代甲酸芐酯，攪拌反應(yīng)1h，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，用乙醚洗滌2次，水相用6mol/L的HCl調(diào)pH至2左右，用乙酸乙酯萃取50ml×3，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，析出白色結(jié)晶，得化合物Ⅰ。將0.01mol的化合物Ⅰ和0.05mol(3.7ml)的氯化亞砜及2ml四氯化碳加入到50ml長頸燒瓶中，加上冷凝和干燥設(shè)備，回流至無氣體放出，蒸去溶劑至無HCl和SO2放出，再加入干燥的二氯甲烷10ml，然后蒸去溶劑，得化合物Ⅱ。

圖1 拌種靈丙氨酸衍生物合成路線

在100ml的長頸燒瓶中，將拌種靈原藥樣品0.01mol(2.33g)溶于25ml的經(jīng)金屬鈉干燥過的四氫呋喃中，通干燥的氮?dú)?，加?.1ml干燥的三乙胺，冰浴中分次少量滴加0.01mol的化合物Ⅱ。60℃回流3h，冷卻至室溫，反應(yīng)15h，薄層色譜跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。待反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸去四氫呋喃，體系溶于50ml的二氯甲烷中，混合物用15ml水洗，15ml 0.5mol/L的HCl溶液洗滌，15ml NaHCO3飽和溶液洗滌，再用水洗至中性。有機(jī)相用MgSO4干燥，蒸去溶劑，柱層析凈化，流動(dòng)相為石油醚和乙酸乙酯梯度洗脫。產(chǎn)物為白色固體Ⅲ。在50ml的圓底燒瓶中加入待脫保護(hù)的化合物0.01mol，加入HBr的冰醋酸溶液10ml，常溫反應(yīng)2h，減壓濃縮蒸發(fā)掉HBr和冰醋酸，加入10ml水溶解，加入0.5mol/L的NaOH溶液至不再產(chǎn)生沉淀，過濾，用10ml的冰水洗固體，然后用甲醇重結(jié)晶，得產(chǎn)物Ⅳ，產(chǎn)率為47%，白色固體，熔點(diǎn)高于260℃。

(2)室內(nèi)抑菌活性試驗(yàn) 采用菌絲生長速率抑制法[11]測定拌種靈氨基酸衍生物室內(nèi)抑菌活性，并用拌種靈原粉作為對(duì)照，按照下式計(jì)算藥液對(duì)菌絲生長的抑制率，計(jì)算藥劑對(duì)水稻紋枯病菌的EC50。

(3)懸浮培養(yǎng)條件下大豆細(xì)胞對(duì)拌種靈氨基酸衍生物的吸收檢測 配制一定量的植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的營養(yǎng)液，滅菌處理。準(zhǔn)確稱取一定量的拌種靈氨基酸衍生物，用少量溶劑溶解后，用營養(yǎng)液定容到一定體積，使?fàn)I養(yǎng)液中供試藥劑的濃度為20mg/L。將處于生長旺盛期的植物細(xì)胞過濾，迅速轉(zhuǎn)入含藥營養(yǎng)液中，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)一定時(shí)間，按照文獻(xiàn)[12]的方法利用HPLC分別測定0.5、1、2、3、5h后細(xì)胞中供試藥劑的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 拌種靈氨基酸衍生物的表征

目標(biāo)化合物拌種靈氨基酸衍生物(化合物IV)的結(jié)構(gòu)經(jīng)NMR和MS分析，核磁共振譜測定結(jié)果如下：1HNMR (400MHz,CH3COCH3)δ：1.38(d,J=6.8,3H,CH3-C-N),2.62(s,3H,CH3-thiazol),3.79(t,J=6.8,1H,OC-CH-N),7.08～7.78(m,5H,C6H5)。13CNMR (400MHz,CH3COCH3) δ： 16.1,17.5,54.1,120.0,121.0(2C),124.6,129.4(2C),140.0,152.4,156.4,161.5,176.2；質(zhì)譜測定結(jié)果為(ESI-MSm/z)： 609.4[2M+H]+,305.2[M+H]+,234.2[M-C3H6NO]+。

2.2 拌種靈氨基酸衍生物室內(nèi)抑菌活性

以水稻紋枯病菌為供試菌種，拌種靈丙氨酸衍生物對(duì)水稻紋枯病菌的毒力曲線方程為y=3.8533+1.2657x，相關(guān)系數(shù)為0.9591，EC50為(8.05±1.25)mg/L。而對(duì)照藥劑拌種靈對(duì)水稻紋枯病的毒力曲線方程為y=4.2592+1.5990x，相關(guān)系數(shù)0.9876，EC50為(2.91±1.39)mg/L。可見，從生物活性的測定結(jié)果看，拌種靈丙氨酸衍生物的生物活性與拌種靈相比有所下降。

2.3 處理不同時(shí)間后大豆細(xì)胞中供試藥劑的含量

圖2 處理不同時(shí)間后細(xì)胞內(nèi)供試藥劑的含量

大豆細(xì)胞分別在20mg/L拌種靈和拌種靈丙氨酸衍生物的液體培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)不同時(shí)間，HPLC測定細(xì)胞內(nèi)化合物含量的結(jié)果見圖2。

從圖2可知，拌種靈進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)的量隨著時(shí)間的推移逐漸增加，到5h時(shí)，也未超過細(xì)胞外的濃度。而拌種靈丙氨酸衍生物進(jìn)入大豆細(xì)胞的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于拌種靈，懸浮培養(yǎng)1h后就高于細(xì)胞外濃度，2h達(dá)到最高值，在隨后的時(shí)間逐漸降低。這一結(jié)果初步說明拌種靈進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的過程是一個(gè)被動(dòng)擴(kuò)散的過程，拌種靈氨基酸衍生物由于存在氨基酸官能團(tuán)，細(xì)胞的吸收可能由于位于細(xì)胞膜上氨基酸的載體參與了運(yùn)載，是個(gè)主動(dòng)吸收的過程。對(duì)于植物細(xì)胞而言，載體的參與可以使細(xì)胞內(nèi)的量高于環(huán)境中的濃度，因此在短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞中化合物含量迅速升高；而這些進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的氨基酸的衍生物畢竟不是植物合成蛋白質(zhì)所需要的氨基酸，因此同樣可以在載體的協(xié)助下被排除細(xì)胞體外。因此當(dāng)細(xì)胞內(nèi)拌種靈丙氨酸衍生物的含量達(dá)到最高值后會(huì)逐漸降低到某一相對(duì)平衡的水平。

3 討論

拌種靈作為一種頂向傳導(dǎo)的內(nèi)吸性殺菌劑，經(jīng)過與丙氨酸化合后形成了拌種靈丙氨酸的衍生物，雖然殺菌活性有一定程度的降低，但其進(jìn)入植物細(xì)胞的能力得到了提升，拌種靈丙氨酸衍生物能夠借助于大豆細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，通過主動(dòng)吸收的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

在農(nóng)藥的施用過程中，人們都努力使藥劑覆蓋有害生物的整個(gè)棲境及被保護(hù)作物本身，由于霧滴飄移和其它環(huán)境因素的影響，到達(dá)生物靶體的農(nóng)藥量極低。以植物體為間接靶體，農(nóng)藥的有效沉積率為20%～40%，損失浪費(fèi)的農(nóng)藥約60%～80%；以農(nóng)業(yè)害蟲為靶體，有效利用率為1/104～1/1011，平均為1/107。而以病原物為靶標(biāo)，能到達(dá)病原物寄居部位的農(nóng)藥有效成分就更低[13]。拌種靈作為一種內(nèi)吸性殺菌劑，殺菌譜廣。但由于單向輸導(dǎo)性，使用受到限制。與丙氨酸結(jié)合后，雖然殺菌活性有所下降，但能在丙氨酸官能團(tuán)的引導(dǎo)下，通過主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞浇尤氪蠖辜?xì)胞。這一過程可能借助于細(xì)胞膜上的氨基酸的載體完成的，因?yàn)榧?xì)胞膜上氨基酸的載體既有一定的專一性，又有一定的廣譜性。目前這些載體蛋白的大多數(shù)調(diào)控基因已經(jīng)被定位，并用這些載體蛋白基因缺失體的植株來進(jìn)行許多克隆基因的生理功能的研究。如命名為YPL265W的DIP5基因能調(diào)控谷氨酸和天門冬氨酸這2種酸性氨基酸的載體蛋白，而命名為YKR039W的GAP1基因幾乎可以調(diào)控常規(guī)的氨基酸的載體蛋白。

一些具有殺菌譜廣、活性高的內(nèi)吸殺菌劑通過衍生，改善其傳導(dǎo)性后有可能煥發(fā)新的活力，是新型殺菌劑開發(fā)的新思路。結(jié)合本研究結(jié)果，對(duì)化合物在植物體內(nèi)的傳導(dǎo)性可作進(jìn)一步深入研究。

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S482.2

A

1673-1409(2012)05-S012-04

2012-04-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30971948)；湖北省教育廳資助項(xiàng)目(Q200712002)；國家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(101048913)。

趙 陽(1988-)，男，寧夏隆德人，現(xiàn)從事新農(nóng)藥開發(fā)研究。

李俊凱，E-mailjunkaili@sina.com。

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.05.004