水蛭提取方法及生理活性的研究

王 艷，楊培民，代 龍，劉國(guó)飛

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355;2.北京和潤(rùn)創(chuàng)新醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，北京 100021)

水蛭為臨床常用中藥，廣泛應(yīng)用于各種血瘀癥，《中國(guó)藥典》記載水蛭具有破血通經(jīng)，逐瘀消癓等功效［1］。目前水蛭臨床一般以原粉、水煎煮、水煎醇沉等方法應(yīng)用，存在服用量大、易被微生物污染等缺點(diǎn)。現(xiàn)代藥理研究表明，動(dòng)物類藥材發(fā)揮作用的主要為其小肽類成分［2］，因此，筆者擬采用酶解方法得到其小肽類成分，然后與上述幾種常規(guī)方法所得提取液比較生理活性。

1 材料

1.1 動(dòng)物

Wistar大鼠70只，雌雄各半，體重(200±20)g，購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)為:SCXK(魯)20090056。

1.2 儀器

高速萬(wàn)能粉粹機(jī)，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;W-O型恒溫水浴鍋，上海申順生物科技有限公司;DZF-605型真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試劑及藥品

胃蛋白酶(酶活力1∶3 000，批號(hào):091015)、胰蛋白酶(酶活力1 000～1 500 u/mg，批號(hào):091105)，均購(gòu)自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;牛纖維蛋白原(供凝血酶效價(jià)測(cè)定用，批號(hào):140626-2001009)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物檢定所，臨用前配制為7mg/mL溶液;凝血酶(500 U)，購(gòu)自浙江杭康藥業(yè)有限公司，臨用前配制為10 U/mL溶液;瓊脂糖，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;考馬斯亮藍(lán)R-250，購(gòu)自上海展云化工有限公司，臨用前配制為0.05%溶液;其余試劑均為分析純;

水蛭購(gòu)自濟(jì)南建聯(lián)中藥店，經(jīng)本校周鳳琴教授鑒定系水蛭科動(dòng)物螞蝗Whitmania pigra Whitman的干燥全體，60℃真空干燥，粉碎成80目細(xì)粉，備用。

2 方法

2.1 樣品的制備

2.1.1 勻漿提取 取水蛭細(xì)粉100 g，加10倍水勻漿，持續(xù)10 min，取出，離心，上清液濃縮至含生藥量0.2 g/mL，濾過，即為勻漿液。

2.1.2 水煎煮提取 取水蛭細(xì)粉100 g，加10倍水勻漿，持續(xù)10 min，取出，煮沸30 min，離心，殘?jiān)偌?0倍水煮沸30 min，離心，合并上清液，濃縮至含生藥量0.2 g/mL，濾過，即為水煎煮液。

2.1.3 水煎醇沉提取 取水蛭細(xì)粉100 g，加10倍水勻漿，持續(xù)10 min，取出，煮沸30 min，離心，殘?jiān)偌?0倍水煮沸30 min，離心，合并上清液，加入乙醇使含醇量達(dá)70%，靜置12 h，濾過，濾液減壓回收乙醇，濃縮至含生藥量0.2 g/mL，濾過，即為水提醇沉液。

2.1.4 胃蛋白酶酶解提取 取水蛭細(xì)粉100 g，加10倍水勻漿，持續(xù)10 min，取出，煮沸15 min，冷至40℃，調(diào)pH至2.0，加入藥材量1%的胃蛋白酶，40℃保溫酶解4 h，取出，煮沸30 min，離心，取上清液，濃縮至含生藥量0.2 g/mL，微孔濾膜濾過，即為胃蛋白酶酶解液。

2.1.5 胰蛋白酶酶解提取 取水蛭細(xì)粉100 g，加10倍水勻漿，持續(xù)10 min，取出，煮沸15 min，冷至40℃，調(diào)pH至8.0，加入藥材量1%的胰蛋白酶，40℃保溫酶解4 h，取出，煮沸30 min，離心，取上清液，濃縮至含生藥量0.2 g/mL，濾過，即為胰蛋白酶酶解液。

2.1.6 仿生酶解提取 取水蛭細(xì)粉100 g，加10倍水勻漿，持續(xù) 10 min，取出，煮沸 15 min，放冷至40℃，調(diào)pH至2.0，加入藥材量1%的胃蛋白酶，40℃保溫酶解1 h，調(diào)pH至8.0，加入藥材量1%的胰蛋白酶，40℃保溫酶解3 h，取出，煮沸30 min，離心，取上清液，濃縮至含生藥量0.2 g/mL，濾過，即得仿生酶解液。

2.2 得膏率的測(cè)定

取提取液各25mL，濃縮，干燥，計(jì)算得膏率。

2.3 抗凝活性

凝血酶原時(shí)間(PT)法［3］:大鼠腹腔靜脈取血，3.8%枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝，混合后，以3 000 r/min 離心15 min，取上清液，得到貧血小板血漿，分別取血漿0.1mL，加入樣品液0.1mL，混勻，37 ℃保溫30 min，再加入已預(yù)熱至37℃的凝血酶溶液(10 U/mL)0.2mL，混勻，記錄出現(xiàn)絮狀沉淀所需時(shí)間。

2.4 溶纖活性

取瓊脂糖0.8 g，加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.6)100mL，加熱使溶解，冷卻至55℃，加入纖維蛋白原溶液(7 g/mL)8mL及凝血酶溶液(10 U/mL)5mL，混勻，立即倒入已預(yù)熱的培養(yǎng)皿中，待冷卻后轉(zhuǎn)移至7℃冰箱中放置20 min，用直徑0.5 cm打孔器打孔。每個(gè)孔中均加入不同上述樣品液20μL，以生理鹽水、磷酸鹽緩沖液(pH 7.6)做空白對(duì)照，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h。取出，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色20 min，脫色液脫色，觀察纖維蛋白溶圈，記錄溶圈垂直直徑［4］。

2.5 大鼠凝血時(shí)間(CT)及靜脈血栓重量(TW)

取Wistar大鼠70只，雌雄各半，體重(200±20)g，隨機(jī)分為7組，每組10只，按表3分組。樣品液組灌胃給藥，1次/d，給藥劑量均為相當(dāng)于生藥量 0.4 g/kg。

空白對(duì)照組灌胃給予同體積生理鹽水，連續(xù)7d。末次給藥后1 h，各組動(dòng)物腹腔注射2.0%戊巴比妥鈉麻醉，剖腹分離下腔靜脈，于左腎靜脈下穿一絲線結(jié)扎下腔靜脈管，造成瘀血，關(guān)閉腹腔。6 h后，用內(nèi)徑為1 mm的玻璃毛細(xì)管插入鼠內(nèi)眥靜脈叢取血，至毛細(xì)管血柱達(dá)5 mm，每隔30 s折斷毛細(xì)管一段，檢查有無(wú)出現(xiàn)凝血絲，計(jì)算毛細(xì)管采血到出現(xiàn)血凝絲時(shí)間，即為凝血時(shí)間。再次打開腹腔，于結(jié)扎下方2 cm處夾閉血管，縱行剖開，取出血栓，記錄血栓重量［5-6］。

3 結(jié)果

3.1 各種提取方法對(duì)得膏率的影響

結(jié)果見表1。

3.2 各種提取方法對(duì)抗凝活性、溶纖活性的影響

結(jié)果見表2。勻漿液、水煎煮液、水煎醇沉液組抗凝活性與空白對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05);各酶解組PT較勻漿液組有較大延長(zhǎng)，與空白對(duì)照組相比有極顯著性差異(P＜0.01)，其中胃蛋白酶酶解液組與勻漿液組相比有顯著性差異(P＜0.05)，仿生酶解液組與勻漿液組相比有極顯著性差異(P＜0.01)。勻漿液、水煎煮液、水煎醇沉液組纖溶活性與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05);各酶解液組纖溶活性與空白對(duì)照組相比有極顯著性差異(P＜0.01)，其中仿生酶解液組與勻漿液組相比有極顯著性差異(P＜0.01)。

表2 抗凝活性、溶纖活性的測(cè)定結(jié)果(±s，n=10)Tab.2 Result of anticoagulant and thrombolysis(±s，n=10)

與空白對(duì)照組比較:1P＜0.05，2 P＜0.01;與勻漿組比較:3P＜0.05，4 P＜0.011P＜0.05，2 P＜ 0.01 vs control group;3P＜ 0.05，4P＜ 0.01 vs homogenate group

組 別 PT/s 溶纖活性/mm勻漿液 23.15±2.451 8.7±2.11水煎煮液 24.67±2.271 10.6±1.61水煎醇沉液 22.35±3.161 10.9±1.61胃蛋白酶酶解液 31.47±2.532，3 14.9±1.82，3胰蛋白酶酶解液 29.65±1.952 14.5±2.12仿生酶解液 45.12±2.562，4 20.9±2.12，4空白對(duì)照液15.49±1.85 5.1±0.2

3.3 提取方法對(duì)大鼠CT及TW的影響

結(jié)果見表3。勻漿液、水煎煮液、水煎醇沉液組CT、TW與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05);各酶解液組CT、TW與空白對(duì)照組相比有極顯著性差異(P＜0.01)，其中胰蛋白酶酶解液組CT、TW與勻漿液組相比均有顯著性差異(P＜0.05)，仿生酶解液組CT、TW與勻漿液組相比有極顯著性差異(P＜0.01)。

表3 大鼠CT及TW測(cè)定結(jié)果(±s，n=10)Tab.3 Result of clotting time and venous thrombosis(±s，n=10)

表3 大鼠CT及TW測(cè)定結(jié)果(±s，n=10)Tab.3 Result of clotting time and venous thrombosis(±s，n=10)

與空白對(duì)照組比較:1 P＜0.05，2 P＜0.01;與勻漿液組比較:3 P＜0.05，4 P＜0.011P＜0.05，2P＜ 0.01 vs control group;3P＜ 0.05，4P＜ 0.01 vs homogenate group

煎醇沉液組蛋白酶酶解液組 105.30±13.272 18.73±3.062，3胰蛋白酶酶解液組 111.81±21.562，3 17.47±2.142，3仿生酶解液組 160.57±21.262，4 14.35±2.682，4空白對(duì)照組61.85±11.24 21.34±2.96

4 討論

水蛭為貴重藥材，一般的勻漿法、水煎煮、水煎醇沉等工藝的得膏率較低，其藥材利用率低，提取后的藥渣仍有較大活性;胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解得膏率稍有增加，但仍不能使藥材得到較好的利用;仿生酶解法的得膏率高，酶解后的藥渣基本沒有活性，能夠較好的利用藥材，是理想的水蛭提取方法。

水蛭藥材細(xì)粉經(jīng)勻漿后，為使大分子蛋白受熱變性，破壞其空間結(jié)構(gòu)，從而易于蛋白質(zhì)的水解，故先煮沸15 min。

本研究創(chuàng)新性提出，模擬人體消化過程，對(duì)動(dòng)物類藥材采用先以胃蛋白酶酶解、再以胰蛋白酶酶解的仿生酶解方法。參考文獻(xiàn)［7-8］，確定本實(shí)驗(yàn)中胃蛋白酶的反應(yīng)條件為40℃，pH 2.0，時(shí)間1 h;胰蛋白酶反應(yīng)條件為40℃，pH 8.0，時(shí)間3 h。

朱正光等［9］研究發(fā)現(xiàn)，水蛭水煎液及其醇溶部分含抗凝活性物質(zhì)，水煎液及其非醇溶部分含纖溶活性物質(zhì)。本文采用仿生酶解的方法，將水蛭中的大分子蛋白酶解成水溶性的小分子肽，所得的酶解液同時(shí)具有抗凝及纖溶活性，而且較水煎液的活力更強(qiáng)，可更大程度提高生物利用度，降低毒副反應(yīng)發(fā)生率。

水蛭細(xì)粉直接口服，只有少部分經(jīng)胃腸道消化吸收，大部分以原型排出體外，大大浪費(fèi)藥材。而經(jīng)體外仿生酶解后，將大分子的蛋白直接降解為小分子的肽，與人體經(jīng)自身胃腸道消化吸收的物質(zhì)相同，能直接吸收入血，生物利用度高，抗凝血、溶栓作用等生理活性更強(qiáng)，而且比一般的酶解方法更優(yōu)，說明對(duì)水蛭進(jìn)行體外仿生酶解得到小肽是一種極好的提高藥物療效的方法。

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