羥乙葛根素對大鼠局灶性腦缺血再灌注氧化損傷的保護作用

余雪源，仲 英，左春旭，張岫美

(1.山東大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)研究所，山東 濟南 250012;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，山東 濟南 250062)

羥乙葛根素(hydroxyethylpuerarin，化合物 N-2035)是葛根素(puerarin)經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后得到的新型異黃酮類化合物，脂溶性增加，可以通過血腦屏障。我們以往的研究證明，羥乙葛根素具有減輕腦缺血再灌注損傷，提高腦的總抗氧化能力，抑制細(xì)胞凋亡，抗炎、抑制興奮性氨基酸——谷氨酸的釋放，保護低氧低糖損傷的大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞，保護過氧化氫損傷的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，阻斷β腎上腺素受體等作用［1-11］。本文以大鼠大腦中動脈阻塞制備缺血再灌注損傷模型，研究羥乙葛根素對再灌注損傷大鼠神經(jīng)病學(xué)評分、腦梗死面積和清除超氧陰離子(·O－2)和羥自由基(·OH)能力的影響，探討羥乙葛根素保護腦缺血再灌注損傷的作用及作用機制。

1 材料

1.1 儀器

TGL-16G型冷凍離心機和L8-80型低溫超速離心機，美國 Beckman公司;尼龍栓線，自制;UV-2102PCS型紫外可見分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑

羥乙葛根素和葛根素，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所;·OH測定試劑盒、·O－2測定試劑盒和蛋白定量(雙縮脲法)測定試劑盒，南京建成生物研究所;氯化三苯四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)上海試劑三廠。

1.3 動物

健康雄性Wistar大鼠，體重275～325 g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(魯)20050017。

2 方法

2.1 動物分組

Wistar大鼠隨機分為:①缺血再灌注組15只，水5mL/kg;②假手術(shù)組10只，水5mL/kg;③葛根素組15只，25mg/kg;④羥乙葛根素低劑量組15只，5mg/kg;⑤羥乙葛根素中劑量組15只，25mg/kg;⑥羥乙葛根素高劑量組15只，125mg/kg。分別于術(shù)前10 d灌胃給藥，以后1次/d。每組選取其中成功制備局灶性腦缺血模型的10只大鼠進行實驗。

2.2 模型制備

參考Zea Longa等的方法［12］并進行改進，制備大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注損傷模型。大鼠經(jīng)水合氯醛(300mg/kg，ip)麻醉后仰臥位，頸正中切口，鈍性分離出左側(cè)頸總動脈和頸外動脈，在頸外動脈發(fā)出約0.8 cm處結(jié)扎。在頸外動脈下方小心分離出頸內(nèi)動脈。將一端已加熱成圓珠狀的尼龍漁線插入頸總動脈，經(jīng)頸總動脈分叉處，并將預(yù)先放入頸總動脈根部的絲線敷緊，將尼龍漁線緩緩?fù)迫胫链竽X前動脈(約20 mm)再往回拉2 mm即至大腦中動脈口。縫合肌肉和皮膚。缺血1 h后，將尼龍漁線抽出使頭端回到CCA處即可使動脈恢復(fù)再通，再灌24 h。手術(shù)過程中保持室溫在25℃，維持大鼠的體溫在37℃。假手術(shù)組大鼠只進行麻醉和血管分離術(shù)。

2.3 神經(jīng)病學(xué)評分

模型大鼠清醒后可觀察到同側(cè)Horner征和對側(cè)以前肢為重的偏癱，主要表現(xiàn)為右前肢內(nèi)收，肩內(nèi)旋，提尾懸空時，右前肢緊貼胸壁，行走時向右側(cè)旋轉(zhuǎn)，右側(cè)肌張力下降。再灌注24 h后參照Longa方法［13］進行5分制行為評分。評分標(biāo)準(zhǔn):無明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀為0分;不能完全伸展右側(cè)前抓為1分;身體向右側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分;行走時向右側(cè)傾倒為3分;不能自行行走為4分。滿分為11分，積分越高，說明動物行為學(xué)障礙越明顯。0和4分的動物棄之不用。

2.4 生化指標(biāo)測定

缺血再灌注24 h后，處死大鼠，迅速取腦稱重。用生理鹽水制成10%腦組織勻漿，4℃，3 000 r/min離心10 min，取上清液即為10%腦組織勻漿。留取1mL低溫10 000 r/min離心10 min，上清液即為胞漿，沉淀為線粒體。參照試劑盒說明書測定大鼠腦組織勻漿、胞漿和線粒體的·O－2和·OH水平。

2.5 梗死范圍的測定

大鼠斷頭處死，迅速取左腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，沿冠狀面切成約2 mm/片的腦片6片，放入3%TTC溶液3mL和1 mmol/L K2HPO4溶液0.1mL，避光，37℃溫浴30 min。正常組織染色后呈紅色，梗死部位呈白色。將切片用數(shù)碼照相機拍攝后輸入計算機，利用形態(tài)學(xué)分析系統(tǒng)電腦軟件(江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司)進行計算:腦梗死面積(%)=梗死組織面積/腦總量×100%。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)生物學(xué)評分

結(jié)果見表1。缺血再灌注損傷組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)，而葛根素和羥乙葛根素各劑量組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分則顯著低于缺血再灌注損傷組(P＜0.01)。

表1 羥乙葛根素對大鼠缺血再灌注損傷24 h神經(jīng)障礙評分的影響(n=10，±s)Tab.1 Effect of hydroxyethylpuerarin on neurological deficit score after 24 h middle cerebral artery reperfusion rats(n=10，±s)

表1 羥乙葛根素對大鼠缺血再灌注損傷24 h神經(jīng)障礙評分的影響(n=10，±s)Tab.1 Effect of hydroxyethylpuerarin on neurological deficit score after 24 h middle cerebral artery reperfusion rats(n=10，±s)

與假手術(shù)組比較:1 P＜0.01;與缺血再灌組比較:2 P＜0.011P＜0.01 vs sham group;2 P＜0.01 vs ischemia reperfusion group

組 別 劑量/(mg/kg) 神經(jīng)障礙評分/分假手術(shù)組 －0.61±0.06缺血再灌注組 － 3.11±0.291葛根素組 25 1.26±0.172羥乙葛根素低劑量組 5 1.31±0.252羥乙葛根素中劑量組 25 1.24±0.192羥乙葛根素高劑量組 125 1.18±0.242

3.2 羥乙葛根素對大鼠缺血再灌注損傷腦組織清除·O－2能力的影響

見表2。與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組大鼠腦組織勻漿、胞漿和線粒體清除·O－2能力顯著降低(P＜0.01)，而羥乙葛根素和葛根素組則顯著提高(P＜0.05 或 P＜0.01)。

3.3 羥乙葛根素對大鼠缺血再灌注損傷腦組織清除·OH能力的影響

表2 羥乙葛根素對大鼠缺血再灌注損傷腦組織清除·能力的影響(n=10，±s)Tab.2 Effects of hydroxyethylpuerarin on scavengering· in focal brain injury rats induced by ischemia reperfusion(n=10，±s)

表2 羥乙葛根素對大鼠缺血再灌注損傷腦組織清除·能力的影響(n=10，±s)Tab.2 Effects of hydroxyethylpuerarin on scavengering· in focal brain injury rats induced by ischemia reperfusion(n=10，±s)

葛根素組 25 43.64±9.45334.81±57.1945.97±9.95羥乙葛根素低劑量組 5 52.91±6.972 376.21±48.502 55.69±7.342羥乙葛根素中劑量組 25 44.31±8.403 337.85±55.912 51.83±9.823羥乙葛根素高劑量組 125 42.72±9.412 329.72±49.37 44.97±8.113

與假手術(shù)組比較:1P＜0.01;與缺血再灌組比較:2P＜0.05，3P＜0.01

1P＜0.01 vs sham;2P＜0.05，3P＜0.01 vs ischemia reperfusion group

表3 羥乙葛根素對大鼠缺血再灌注損傷腦組織清除·OH能力的影響(n=10，±s)Tab.3 Effects of hydroxyethylpuerarin on scavengering ·OH in focal brain injury rats induced by ischemia reperfusion(n=10，±s)

表3 羥乙葛根素對大鼠缺血再灌注損傷腦組織清除·OH能力的影響(n=10，±s)Tab.3 Effects of hydroxyethylpuerarin on scavengering ·OH in focal brain injury rats induced by ischemia reperfusion(n=10，±s)

與假手術(shù)組比較:1 P＜0.01;與缺血再灌組比較:2 P＜0.05，3 P＜0.011 P＜0.01 vs sham;2 P＜0.05，3 P＜0.01 vs ischemia reperfusion group

葛根素組羥乙葛根素低劑量組 5 9.77±3.353 33.74±10.773 10.12±3.473羥乙葛根素中劑量組 25 11.95±4.112 34.37±11.763 14.31±4.922羥乙葛根素高劑量組 125 10.89±2.572 38.97±11.572 11.28±2.663

見表3。與假手術(shù)組相比，缺血再灌注損傷組大鼠腦組織勻漿、胞漿和線粒體清除·OH能力降低(P＜0.01);羥乙葛根素和葛根素均可顯著提高腦組織勻漿、胞漿和線粒體清除·OH的能力(P＜0.05，P＜0.01)。

3.4 羥乙葛根素對大鼠缺血再灌注損傷腦組織梗死面積的影響

見表4。與假手術(shù)組相比，缺血再灌注損傷大鼠腦梗死面積明顯增加(P＜0.01)。與缺血再灌注損傷組相比，羥乙葛根素和葛根素均可使腦梗死面積顯著縮小(P＜0.01)。

表4 羥乙葛根素對大鼠缺血再灌注損傷腦組織梗死面積的影響(n=10，±s)Tab.4 Effects of hydroxyethylpuerarin on infarction area in focal brain injury rats induced by ischemia reperfusion(n=10，±s)

與假手術(shù)組比較:1 P＜0.01;與缺血再灌組比較:2P＜0.011P＜0.01 vs sham;2 P＜0.01 vs ischemia reperfusion group

組 別 劑量/(mg/kg) 梗死面積/%假手術(shù)組 －0±0缺血再灌組 － 37±111葛根素組 25 18±92羥乙葛根素低劑量組 5 19±62羥乙葛根素中劑量組 25 27±82羥乙葛根素高劑量組 125 20±62

4 討論

缺血性腦血管病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病，其發(fā)病率、致殘率和死亡率均較高，已成為人類主要死亡原因之一。近年日益增多的證據(jù)表明，在缺血性腦血管病損傷的病理過程中，氧自由基的產(chǎn)生是一個關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。缺血再灌注對腦血管產(chǎn)生危害作用的氧自由基主要是·和·OH。氧自由基在體內(nèi)的變化，可直接反映脂質(zhì)過氧化的水平活性高低。根據(jù)Haber-Weiss反應(yīng)以及在游離Fe2+的存在的條件下，·更容易歧化成H2O2，根據(jù)Fenton反應(yīng)，H2O2能生成比·更具活性與毒性的·OH。本實驗?zāi)M體內(nèi)產(chǎn)主大量自由基的組織，進一步觀察組織清除·OH和·的能力。

與缺血再灌注損傷組相比，羥乙葛根素和葛根素可以顯著提高機體清除·OH和·的能力，且羥乙葛根素的作用強于葛根素，說明羥乙葛根素可能通過清除氧自由基對缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護作用。

TTC是腦組織缺血性損傷的標(biāo)記物。TTC受氫后形成紅色，能使正常組織染成深紅色，而缺血組織則無顏色反應(yīng)［14］，因此，能清晰地顯示缺血組織的范圍和邊界，特點是簡便快速、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強，目前已被廣泛用于標(biāo)記腦梗死面積。本實驗病理形態(tài)學(xué)觀察，TTC染色用藥組大鼠腦組織壞死灶比缺血再灌注損傷模型大鼠明顯輕，梗死區(qū)面積也低于損傷模型組大鼠，說明羥乙葛根素有增加局部組織血流量，促進神經(jīng)功能的恢復(fù)。本實驗中缺血灶的位置和范圍與大腦中動脈供應(yīng)區(qū)一致，顯示局灶性大鼠腦缺血損傷模型制備成功。

為探討羥乙葛根素對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護作用的量效關(guān)系，我們在的過去使用劑量的基礎(chǔ)上，設(shè)計了5，25和125mg/kg三個劑量組。研究結(jié)果顯示，除大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分以及清除·能力有劑量依賴性的趨勢外，對大鼠腦梗死面積的縮小和清除·OH能力則劑量依賴關(guān)系不明顯，提示整體動物實驗，應(yīng)當(dāng)進一步觀察較低劑量羥乙葛根素的反應(yīng)，以期找到合適的劑量，為臨床研究提供實驗依據(jù)。

本實驗證明，羥乙葛根素改善缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分，缺血再灌注損傷腦梗死面積，提高缺血大鼠腦組織清除氧自由基的能力，提示羥乙葛根素對局灶性腦缺血損傷具有保護作用，該作用可能與其清除·和·OH，發(fā)揮抗氧化作用有關(guān)。腦缺血再灌損傷的病理生理學(xué)機制復(fù)雜，羥乙葛根素保護再灌注腦損傷的作用機制需進一步探討。

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