E838對再生障礙性貧血小鼠造血功能的治療作用

張 恒，王月英，李德冠，王小春，路 璐，吳紅英，常建輝，翟志斌，孟愛民

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所 天津市分子核醫(yī)學(xué)重點實驗室，天津 300192)

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是由于生物、化學(xué)、物理等因素導(dǎo)致造血組織功能減退或衰竭而引起全血細胞減少，臨床表現(xiàn)為貧血、感染、出血等癥狀的一組綜合征，是造血系統(tǒng)比較常見的疾?。?］。目前臨床上廣泛使用的治療方法都存在缺點，如雄激素法對改善血小板效果不佳且副作用大，骨髓移植法配型困難且遠期免疫抑制劑使用成本高，免疫抑制劑法成本高且遠期并發(fā)癥嚴重;開發(fā)安全、有效、成本低的AA治療方法具有良好的臨床應(yīng)用前景。

E838(17a-D-高炔雌二醇-3-乙酯)是我們對炔雌醇結(jié)構(gòu)進行改造合成的一種新型雌激素類化合物，分子式為C23H28O3，相對分子質(zhì)量352。我們研究小組前期研究表明，E838、炔雌醇、尼爾雌醇、雌三醇等雌激素類物質(zhì)對放療、化療導(dǎo)致的造血系統(tǒng)損傷具有一定的防護作用［2］，其中E838的防護作用最強、雌激素活性最低［3］，在放化療病人恢復(fù)造血機能的臨床應(yīng)用上具有良好前景。在本項研究中，我們改進了Barnes的經(jīng)典造模方法［4］，采用電離輻射和免疫介導(dǎo)結(jié)合的方法誘導(dǎo)小鼠AA模型并用E838進行干預(yù)，考察外周血常規(guī)、網(wǎng)織紅細胞(Reticulocyte，Ret)計數(shù)和骨髓病理等多項指標，評估AA動物模型的有效性和E838對AA的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

近交系BALB/c小鼠30只，體重20～22 g，雄性，由中國輻射防護研究院提供，合格證號:SCXK(京)2007-0001;近交系DBA/2小鼠2只，體重22～24 g，雄性，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，合格證號:SCXK(京)2005-0013。飼料為清潔級全價鼠料，由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供。

1.2 試劑及儀器

E838為我所自行制備;注射用茶油，天津氨基酸公司生產(chǎn)，配制E838使用液，濃度為750μg/mL。

pocH-100i自動血細胞計數(shù)儀，日本希森美康株式會社;BX51正置顯微鏡，日本奧林巴斯公司;RM2235石蠟切片機，德國萊卡公司。

1.3 照射條件

天津市物理技術(shù)研究所60Co源γ射線，劑量為5.0 Gy，劑量率為1.1 Gy/min。

1.4 方法

1.4.1 動物分組 取生長良好的BALB/c小鼠30只，隨機分為3組，每組10只，即對照組、AA模型組(AA組)、E838干預(yù)組(E838組)。

1.4.2 動物處理 對照組進行假照射，AA組、E838組進行全身照射;AA組、E838組小鼠參考Barnes方法［4］建立AA動物模型;E838組小鼠建模后給E838茶油溶液進行干預(yù)實驗。

1.4.3 給藥方式 E838組劑量為75μg(0.1mL)/只，制備模型當天灌胃給藥，其余各組小鼠給予等體積茶油，1次/d，連續(xù)14 d。

1.5 指標測定

1.5.1 一般生長狀態(tài)觀察 包括一般行為、毛發(fā)、出血點及死亡情況。

1.5.2 外周血常規(guī)參數(shù)測定模型制備至第15天，小鼠稱重，眼球取血200μL，EDTA-K3抗凝，用自動血細胞計數(shù)儀測定外周血白細胞數(shù)(WBC)、紅細胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、血小板計數(shù)(PLT)等指標。

1.5.3 Ret計數(shù) 眼球取血100μL，加入1%煌焦油藍溶液50μL，混勻放入37℃水浴鍋中染色15 min，取出后推片，再進行瑞氏染色，油鏡下計數(shù)1 000個紅細胞中的Ret。

1.5.4 骨髓有核細胞計數(shù) 處死小鼠，取小鼠左側(cè)股骨，用沖洗液2mL沖出骨髓，在血細胞計數(shù)儀上測定骨髓有核細胞數(shù)。

1.5.5 病理學(xué)觀察 取小鼠右側(cè)股骨，常規(guī)固定、脫水、脫鈣、石蠟包埋，石蠟塊用石蠟切片機制作5 μm切片，切片HE染色后用中性樹脂封片，用正置顯微鏡進行組織學(xué)觀察并采集圖像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有資料處理用SPSS16.0版軟件包進行分析，檢測結(jié)果以(±s)表示，經(jīng)Levene檢驗后，采用LSD法檢驗比較組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般生長狀況

從第5天開始，AA組小鼠陸續(xù)出現(xiàn)活動減少、攝食減少，第8天出現(xiàn)腹部凹陷、體重下降等情況;E838組小鼠較AA組狀況好，未出現(xiàn)腹部凹陷的情況，體重降低不明顯;至第15天所有小鼠均未出現(xiàn)出血點及死亡現(xiàn)象。

2.2 外周血常規(guī)指標測定

外周血各項指標中(表1)AA組WBC、PLT、RBC、HGB水平均明顯低于對照組(P＜0.05)。E838組與AA組相比，WBC高 163.8%，PLT高39.70%，RBC 高18.14%，HGB 高16.28%。

2.3 Ret計數(shù)

表1 E838對再障小鼠外周血的改善作用(±s，n=10)Tab.1 The therapeutic effect of E838 on peripheral blood of AA mice(±s，n=10)

表1 E838對再障小鼠外周血的改善作用(±s，n=10)Tab.1 The therapeutic effect of E838 on peripheral blood of AA mice(±s，n=10)

與對照組比較:1 P＜0.05;與AA組比較:2 P＜0.05Compared with control group:1 P＜0.05;Compared with irradiation group:2 P＜0.05

組 別 WBC/(109/L) RBC/(1012/L) HGB/(g/L) PLT/(109/L)Ret/‰對照組 6.30±0.36 8.74±0.98 145.0±12.1 1 016.4±88.1 86.2±10.7 AA 組 1.88±0.331 7.00±0.731 120.4±15.11 616.2±125.31 60.0±18.91 E838 組 4.96±0.212 8.27±1.172 140.0±20.6 860.8±94.72 140.5±24.12

經(jīng)煌焦油藍染色后鏡下可見(圖1)，AA組小鼠外周血Ret較對照組明顯減少，E838組Ret水平高于其余各組(表1)。油鏡下計數(shù)，AA組Ret比例較對照組低25.2%(P＜0.05)，E838組高于AA模型組134.2%(P＜0.05)。

圖1 E838對再障小鼠Ret改善作用(1 000×)Fig.1 The ameliorated effect of E838 on reticulocytes of AA mice(1 000× )

2.4 骨髓有核細胞計數(shù)

結(jié)果見表2，再障模型組較對照組低51.8%(P＜0.05)，E838 組高于AA 模型組134.2%(P＜0.05)。

2.5 病理學(xué)檢測

結(jié)果見圖2。骨髓石蠟切片HE染色鏡下觀察，AA組與對照組比較，骨髓增生低下，造血組織顯著減少，脂肪細胞增多，間質(zhì)水腫，血竇擴張，有出血。E838組與AA比較，造血組織有所恢復(fù)，單核細胞增多，間質(zhì)水腫少見，沒有出血現(xiàn)象，脂肪細胞少于AA組。

表2 E838對AA小鼠骨髓單核細胞計數(shù)影響(±s，n=10)Tab.2 The ameliorated effect of E838 on BMMNCs of AA mice(±s，n=10)

表2 E838對AA小鼠骨髓單核細胞計數(shù)影響(±s，n=10)Tab.2 The ameliorated effect of E838 on BMMNCs of AA mice(±s，n=10)

與對照組比較:1 P＜0.05;與AA組比較:2P＜0.05Compared with control group:1P＜0.05;Compared with irradiation group:2P＜0.05

組 別 BMMNCs/(106/femur)對照組6.30±0.36 AA 組 1.88±0.331 E838 組 4.96±0.211，2

圖2 E838治療AA模型小鼠骨髓HE染色(100×)Fig.2 The HE staining of AA mice treated with E838(100× )

3 討論

目前對構(gòu)建AA動物模型的評估方法通常參照臨床AA診斷標準，主要包括:(1)全血細胞減少，Ret絕對值減少;(2)骨髓象三系造血細胞至少二系明顯減少;(3)骨髓造血組織明顯減少，脂肪組織增生［4-6］。在本研究中，建模第15天AA模型組小鼠外周血RBC、PLT、RBC、HGB和Ret較對照組顯著下降，符合建模要求。此外，骨髓有核細胞計數(shù)、骨髓病理HE染色結(jié)果也符合臨床患者相關(guān)表現(xiàn)。綜合分析表明，我們研究中構(gòu)建的AA小鼠模型是成功的，進行相關(guān)藥效學(xué)研究是可靠的。

在本研究中，E838組小鼠建模后灌胃給藥共14 d，第15天對小鼠各項指標進行檢測以驗證E838是否具有治療作用。外周血各項指標中，E838組WBC、RBC、PLT、Ret等指標均明顯高于AA組(P＜0.05);其中Ret值提高明顯，并高于對照組(P＜0.05)，提示E838干預(yù)小鼠的RBC、HGB還將進行性升高，骨髓單核細胞計數(shù)和骨髓病理檢測均提示E838能有效恢復(fù)AA模型小鼠的造血組織機能。

據(jù)報道，有約70%AA患者免疫功能紊亂。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是具有免疫調(diào)節(jié)功能的細胞，AA患者外周血中Treg表達降低，分泌的細胞因子失衡，導(dǎo)致輔助性 T淋巴細胞Ⅰ型(Th1)數(shù)量增多，Thl/Th2比值升高，細胞免疫亢進、自身免疫耐受打破;同時體內(nèi)Treg減少，抑制IL-2產(chǎn)生的能力下降，維持免疫耐受的能力降低，從而體內(nèi)自身活化性T細胞大量增殖，體液免疫亢進，導(dǎo)致再障的發(fā)生。Polancayk等［7-8］研究發(fā)現(xiàn)在妊娠小鼠和經(jīng)雌二醇處理的小鼠體內(nèi)Foxp3表達加強，Treg細胞功能增強，其免疫抑制功能亦加強;Tai等［9］發(fā)現(xiàn)生理劑量的雌二醇可以刺激CD4+CD25-T細胞向CD4+CD25+T細胞轉(zhuǎn)化，使不同組織中的Treg細胞增加，并增加Foxp3的表達;研究同時發(fā)現(xiàn)CD4+CD25-T細胞表面存在雌激素受體，而雌激素受體缺乏的動物Foxp3水平降低。以上證據(jù)表明，雌激素可能通過上調(diào)Treg功能抑制細胞免疫和體液免疫，降低自身免疫介導(dǎo)的造血抑制，提示E838改善AA動物模型造血功能可能是通過Treg介導(dǎo)的，但還需要進一步研究驗證。

在本項研究中，我們成功構(gòu)建了AA小鼠動物模型，并利用這一模型研究了E838對AA模型小鼠造血功能的治療作用。我們推測E838對造血機能的恢復(fù)作用可能是由于其對Treg的上調(diào)而抑制了自身免疫介導(dǎo)的造血抑制，在今后的工作中我們將對這一假說進行研究，并研究其治療作用其他可能的機制，為開發(fā)AA治療藥物提供新的靶點。

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