白藜蘆醇對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲影響機(jī)制研究

艾旭 李昀 鄧沖 胡方靖 武軍駐

白藜蘆醇對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲影響機(jī)制研究

艾旭①②李昀①②鄧沖①②胡方靖①②武軍駐①

目的：觀察白藜蘆醇對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響，并研究其內(nèi)在分子機(jī)制。方法：采用MTT法檢測白藜蘆醇對(duì)Bel-7404細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測白藜蘆醇對(duì)Bel-7404細(xì)胞凋亡的影響；Transwell法檢測白藜蘆醇對(duì)Bel-7404細(xì)胞侵襲的影響。結(jié)果：白藜蘆醇可以抑制Bel-7404細(xì)胞增殖，也可以誘導(dǎo)Bel-7404細(xì)胞凋亡，均呈濃度依賴性，與下調(diào)Procaspase3和PARP蛋白表達(dá)有關(guān)。白藜蘆醇可以抑制Bel-7404細(xì)胞侵襲性，呈濃度依賴性，與下調(diào)MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)有關(guān)。結(jié)論：白藜蘆醇可以抑制肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖，通過剪切Procaspase3、PARP蛋白而誘導(dǎo)凋亡，通過下調(diào)MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)水平而抑制Bel-7404細(xì)胞侵襲性。

白藜蘆醇； 肝癌Bel-7404細(xì)胞； 增殖； 凋亡； 侵襲； 影響

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是從葡萄、虎杖等植物內(nèi)提取的一種多酚類化合物，其在抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和改善微循環(huán)等方面都有一定的生物活性。而近年來多項(xiàng)研究顯示，白藜蘆醇在抗腫瘤治療和化學(xué)預(yù)防方面都顯示出一定的效果[1-3]。目前其在原發(fā)性肝癌的治療方面有一些研究，但其內(nèi)在的抗腫瘤機(jī)制尚不明確[4-5]。本研究旨在觀察白藜蘆醇對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響，并探討其內(nèi)在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌Bel-7404細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫)；白藜蘆醇、噻唑藍(lán)(MTT)(美國sigma公司)；新生牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；纖連蛋白(FN)和基底膜基質(zhì)凝膠Matrigel(美國BD公司)；羊抗鼠Procaspase3，PARP，VEGF，MMP-9(美國Santa cruze公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌Bel-7404細(xì)胞在含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)， 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT增殖檢測 將細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，計(jì)數(shù)，制成2×105/ml的單細(xì)胞懸液，按照每孔100 μl接種與96孔板中，白藜蘆醇的最終濃度分別為25，50，100，200 μmol/L，分別在12、24、48 h孵育后換用不含血清的培養(yǎng)基每孔100 μl，避光條件下每孔加入MTT液10 μl(5 mg/ml)，室溫孵育4 h，棄去上清液，各孔加入DMSO100 μl，搖床震蕩10 min，酶標(biāo)儀(Bio-Rad550型，美國Bio-Rad公司)檢測560 nm的OD值，取3孔平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。抑制率=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測 白藜蘆醇的最終濃度分別為0、25、 50、100 μmol/L孵育細(xì)胞48 h后，0.25%胰酶消化，1000 r/min離心，棄去上清液，用PBS洗一遍，離心得到細(xì)胞團(tuán)。將細(xì)胞重懸于200 μl Binding Buffer，加入5 μl AnnexinV-FITC 和5 μl PI，4 ℃避光30 min，然后立即上流式機(jī)檢測(COULTER EPICS XL型，美國Beckman Coulter 公司)。

1.5 Transwell侵襲檢測 在Transwell小室濾膜的下室面鋪上FN并風(fēng)干后，在小室上表面均勻鋪上1:3 RPMI1640稀釋的Matrigel，置于37 ℃培養(yǎng)箱30 min使之凝固。取1×106/ml Bel-7404細(xì)胞 懸液(培養(yǎng)基為0.1% BSA的RPMI 1640)，加藥組Transwell小室的上室內(nèi)加入白藜蘆醇(終濃度25 μmol，50 μmol/L)，下室內(nèi)分別加入用上述培養(yǎng)基制成白藜蘆醇溶液600 μl，終濃度與上室內(nèi)相同，各組設(shè)3復(fù)孔。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h后取出濾膜，用甲醇固定，用棉簽擦去上內(nèi)面內(nèi)細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色，隨機(jī)于顯微鏡下取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。以計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)目來間接反映腫瘤細(xì)胞侵襲能力大小。

1.6 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 收集各組處理細(xì)胞，每5×106細(xì)胞加入200 μl細(xì)胞裂解液，吹打并劇烈震蕩30 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清液于100 ℃、5 min變性，測蛋白濃度分裝備用，每孔上樣40 μg后電泳，恒流300 mA轉(zhuǎn)膜75 min，轉(zhuǎn)移后的PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后與1:1000鼠抗人MMP-9、Pro-caspase3、PARP-1、VEGF抗體4 ℃孵育過夜，而后加1:1000羊抗鼠抗體，室溫反應(yīng)90 min，化學(xué)發(fā)光法檢測，暗室內(nèi)壓片曝光，顯影后膠片用Genetools軟件分析灰度值。各目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值即為蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)Bel-7404細(xì)胞增殖影響 白藜蘆醇可以明顯抑制Bel-7404細(xì)胞增值，呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。見圖1。

圖1 RES抑制Bel-7404細(xì)胞增殖

2.2 白藜蘆醇對(duì)Bel-7404細(xì)胞凋亡的影響 白藜蘆醇在孵育細(xì)胞48 h后可以誘導(dǎo)Bel-7404細(xì)胞凋亡，呈濃度依賴性。50 μmol/L和100 μmol/L 的濃度可以明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P<0.001)。見圖2。此外白藜蘆醇可以誘導(dǎo)Caspase-3酶原的激活，并剪切凋亡底物PARP-1，引起了凋亡的產(chǎn)生。

圖2 RES誘導(dǎo)Bel-7404細(xì)胞凋亡

2.3 白藜蘆醇對(duì)Bel-7404細(xì)胞侵襲能力的影響 白藜蘆醇可以在25 μmol/L 和50 μmol/L均可以明顯抑制細(xì)胞的侵襲能力，見圖3。并且MMP9和VEGF的蛋白水平表達(dá)也呈濃度梯度下降。

圖3 RES抑制Bel-7404細(xì)胞侵襲能力

3 討論

多項(xiàng)研究顯示，RES在致癌的三個(gè)主要階段均有化學(xué)預(yù)防、抗起始活性、抗促進(jìn)和抗發(fā)展作用。最重要的是RES具有廣泛的抗腫瘤作用和化療、放療增敏作用。RES可以通過誘導(dǎo)多種凋亡通路的激活來實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用，筆者研究發(fā)現(xiàn)，RES可以誘導(dǎo)Bel-7404細(xì)胞凋亡，呈濃度依賴性，并伴隨著Procaspase3和PARP-1蛋白的激活、剪切。程海燕等[6]研究發(fā)現(xiàn)，RES可以通過激活Caspase3通路來誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生，這與筆者的研究結(jié)果一致。因此，筆者考慮RES是通過誘導(dǎo)Caspase3酶原激活、剪切，并引起凋亡的作用底物PARP-1的剪切而引起細(xì)胞凋亡發(fā)生的。Kuo等[7]研究指出，RES還可以通過P53依賴途徑在Hep G2細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)凋亡。至于P53途徑是否是RES在Bel-7404細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的依賴通路還有待進(jìn)一步研究。

肝癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與患者預(yù)后密切相關(guān)，而腫瘤血管生成又是促進(jìn)癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移必不可少的重要生物學(xué)過程之一。而VEGF是腫瘤新生血管形成的必要元素，它的表達(dá)可以作為評(píng)價(jià)腫瘤血管生成的一項(xiàng)指標(biāo)。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的重要成員，主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)，是腫瘤細(xì)胞侵襲和細(xì)胞外基質(zhì)重塑、腫瘤血管基底膜重塑的重要分子基礎(chǔ)，與腫瘤細(xì)胞的侵襲力密切相關(guān)，可以作為評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)弱的一項(xiàng)指標(biāo)。趙占考等[8]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管MVD增高、MMP-2、MMP-9過度表達(dá)可能與肝細(xì)胞肝癌轉(zhuǎn)移、不良生存預(yù)后存在相關(guān)性。筆者的研究結(jié)果顯示，RES可以明顯降低Bel-7404細(xì)胞的侵襲能力，并伴隨VEGF和MMP-9蛋白的下調(diào)。Yu等[4]研究發(fā)現(xiàn)RES可以通過NF-kB信號(hào)通路減少Hep G2肝癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)，從而有效地抑制裸鼠移植瘤的生長和血管生成。

目前抗腫瘤治療趨向于靶向治療和多藥聯(lián)合治療，因此，研究RES特定的分子機(jī)制將給未來肝癌的抗腫瘤治療提供精確地靶點(diǎn)，為聯(lián)合化療提供理論依據(jù)。

[1] Boddicker R L，Whitley E M，Davis J E，et al.Low-dose dietary resveratrol has differential effects on colorectal tumorigenesis in adiponectin knockout and wild-type mice[J].Nutr Cancer，2011，63(8):1328-1338.

[2] Huang X，Zhu H L.Resveratrol and its analogues:promising antitumor agents [J].Anticancer Agents Med Chem，2011，11(5):479-490.

[3] 張瑤，張淑蘭.白藜蘆醇對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞表皮生長因子表達(dá)的影響[J].中國腫瘤臨床，2008，35(15):884-886.

[4] Yu H B，Zhang H F，Zhang X，et al.Resveratrol inhibits VEGF expression of human hepatocellular carcinoma cells through a NF-kappa B-mediated mechanism[J].Hepatogastroenterology，2010，57(102):1241-1246.

[5] 汪維佳，虞娉.白藜蘆醇增強(qiáng)順鉑對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402的生長抑制作用[J].實(shí)用腫瘤雜志，2009，24(2):157-159.

[6] 程海燕，周家華，楊德同.白藜蘆醇誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡通路的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2010，38(5):515-517.

[7] Kuo P L，Chiang L C，Lin C C.Resveratrol-induced apoptosis is mediated by p53-dependent pathway in Hep G2 cells[J].Life Sci，2002，72(1):23-34.

[8] 趙占考，孫保存，孫濤，等.肝細(xì)胞肝癌中微血管密度及MMP-2和MMP-9的表達(dá)與術(shù)后轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系[J].中國腫瘤臨床，2010，37(7):385-387.

10.3969/j.issn.1674-4985.2012.22.006

①武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 湖北 武漢 430060

②湖北省荊門市第一人民醫(yī)院

艾旭

2012-04-10) (本文編輯：連勝利)