央芪湯流浸膏敷貼制劑對(duì)胃癌動(dòng)物模型的干預(yù)作用研究*

唐萬和 孫易娜 趙雷 唐思思 王國金 王紅榮 王熙 余智勇 蔡昂

央芪湯流浸膏敷貼制劑對(duì)胃癌動(dòng)物模型的干預(yù)作用研究*

唐萬和①孫易娜①趙雷②唐思思③王國金①王紅榮①王熙①余智勇①蔡昂①

目的：通過將央芪湯制作成流浸膏制劑，檢測(cè)央芪湯流浸膏制劑對(duì)胃癌動(dòng)物模型中瘤體的抑制作用。方法：將人胃癌SGC-7901細(xì)胞懸液皮下接種于裸鼠背部皮下，當(dāng)接種部位腫瘤長(zhǎng)至最大徑4~5 mm時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為四組(10只/組)：A組(央芪湯敷貼劑)；B 組(氟尿嘧啶注射液)；C組(央芪湯敷貼劑+氟尿嘧啶注射液)；D組(生理鹽水對(duì)照組)。給藥期間觀察裸鼠的一般情況及移植瘤的生長(zhǎng)狀況，連續(xù)用藥24 d，并繼續(xù)觀察4 d后，頸椎脫位處死裸鼠，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法檢測(cè)bcl-2及caspase-3蛋白。結(jié)果：央芪湯流浸膏可明顯提高胃癌細(xì)胞株SGC-7901在裸鼠皮下移植瘤的caspase-3蛋白表達(dá)，顯著抑制SGC-7901在裸鼠皮下移植瘤抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)。結(jié)論：央芪湯流浸膏可以明顯增加荷瘤裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡，有明顯差異，表明央芪湯流浸膏可以通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡達(dá)到抗腫瘤的目的。

央芪湯流浸膏； 胃癌； bcl-2； caspase-3； 中醫(yī)藥

央芪湯是武漢市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科唐萬和主任在治療胃癌的臨床實(shí)踐中總結(jié)出來的經(jīng)驗(yàn)方。臨床研究表明，該方可以穩(wěn)定瘤體，延長(zhǎng)消化道腫瘤患者的生存時(shí)間，提高患者的生存質(zhì)量。前期研究提示其可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究通過將央芪湯制作成流浸膏敷貼制劑，改善藥物透過角質(zhì)層的穿透性，提高藥物滲透量，增強(qiáng)治療效果。在此基礎(chǔ)上，綜合應(yīng)用現(xiàn)代免疫學(xué)、分子生物學(xué)等研究方法，進(jìn)一步揭示央芪湯治療腫瘤的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 BALB/c(nu /nu)裸小鼠，由北京聯(lián)合利華公司提供。4~6周齡；體重：16~20 g；雌性；飼養(yǎng)于無特定病原體(SPF)條件下。動(dòng)物飼料由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 細(xì)胞株 人胃低分化腺癌細(xì)胞株SGC-7901，來自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 藥物 央芪湯流浸膏，由豬央央、生黃芪、敗醬草、白英、白及、黨參、蒲公英、白花蛇舌草、半枝蓮、猴頭菇等藥物組成，中藥由武漢市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)基地提供。

1.1.4 主要試劑 抗人caspase-3 IgG，抗人Bcl-2 IgG，Annexin V -FITC /P I雙染試劑盒，免疫組化S-P試劑盒，RPMI1640培養(yǎng)基，胰蛋白酶，10%胎牛血清。

1.1.5 主要儀器設(shè)備 IMT-2型倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，SW-CJ-2FD型醫(yī)用超凈工作臺(tái)(蘇州凈化集團(tuán)公司)，水浴箱XMT-DA數(shù)顯調(diào)節(jié)儀(北京光明儀器廠)，NAPC02-5420-1型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國精密科學(xué)公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 央芪湯流浸膏制備 將由豬央央、生黃芪、敗醬草、白及、蒲公英、黨參、白花蛇舌草、白英、半枝蓮、猴頭菇等藥物組成的央芪湯制成流浸膏。

1.2.2 人胃癌SGC-7901 細(xì)胞株的培養(yǎng)及傳代 將SGC-7901細(xì)胞吸盡上清液，PBS 液洗滌2次，加入0.25%胰蛋白酶溶液0.5 ml，放置37 ℃恒溫水浴箱中5 min，振蕩后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，搖勻后分瓶，放入5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，長(zhǎng)滿瓶底后如上法分瓶孵育，直至所需的細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試 取清潔血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液與細(xì)胞懸液混勻，從蓋玻片一側(cè)計(jì)數(shù)板凹槽加入，于低倍倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)四角大分格中的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 皮下移植瘤模型的建立 將人胃癌SGC-7901細(xì)胞用0.2%胰酶消化成細(xì)胞懸液，無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×106個(gè)/ml，臺(tái)盼藍(lán)染色記數(shù)活細(xì)胞>95%。用1.0 ml 微量注射器將0.2 ml細(xì)胞懸液皮下接種于裸鼠右側(cè)背部皮下，每只接種0.2 ml。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組 當(dāng)接種部位腫瘤長(zhǎng)至最大徑4~5 mm時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為四組(10只/組)：A 組(央芪湯敷貼劑)：央芪湯敷貼劑外敷荷瘤裸鼠背部皮膚；B 組(氟尿嘧啶注射液)：荷瘤裸鼠腹腔注射氟尿嘧啶注射液；C 組(聯(lián)合組)：荷瘤裸鼠腹腔注射氟尿嘧啶注射液，央芪湯敷貼劑外敷荷瘤裸鼠背部皮膚，1次/d；D 組(空白組)：腹腔注射生理鹽水。

1.2.6 藥物治療 A 組：在裸鼠體表腫瘤部位敷貼央芪湯流浸膏，1次/d。B組：腹腔注射氟尿嘧啶注射液，給藥劑量1 mg/kg，1次/d。 C組：外敷央芪湯流浸膏同時(shí)予以腹腔氟尿嘧啶注射，1 mg/kg，1次/d。D組：裸鼠腹腔注射生理鹽水1 mg/kg，1次/d。

1.2.7 免疫組織化學(xué)法染色實(shí)驗(yàn) 采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法檢測(cè)bcl-2及caspase-3蛋白。腫瘤組織于10%中性緩沖甲醛中固定24 h，石蠟包埋，連續(xù)切片。貼附于涂有多聚賴氨酸的載玻片，60 ℃烤片2 h。組織切片脫蠟，梯度乙醇水化，細(xì)胞固定。放進(jìn)3% H2O2-甲醇液， 室溫下20 min。1% Triton X-100 37 ℃ 5 min，水洗，PBS洗。正常山羊血清室溫20 min。滴加兔抗P65 IgG，4 ℃過夜。PBS洗，滴加Biotin-羊抗兔IgG，37 ℃，30 min。PBS洗，滴加HRP標(biāo)記鏈霉親和素，37 ℃，30 min。PBS洗3×5 min 后，DAB 顯色；常規(guī)脫水、透明、封片。結(jié)果判定: 陽性物質(zhì)呈棕黃色。每張免疫細(xì)胞化學(xué)片在20×10的倍數(shù)下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算總細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)及陽性率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(±s)表示，多組均數(shù)間的比較采用F 檢驗(yàn)，多重比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

藥物干預(yù)24 d后，央芪湯流浸膏可以提高胃癌細(xì)胞株SGC-7901在裸鼠皮下移植瘤的caspase-3蛋白表達(dá)，央芪湯流浸膏組和聯(lián)合組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。央芪湯流浸膏組與聯(lián)合組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 央芪膏、氟尿嘧啶對(duì)SGC-7901裸鼠皮下移植瘤caspase-3的影響(±s)

表1 央芪膏、氟尿嘧啶對(duì)SGC-7901裸鼠皮下移植瘤caspase-3的影響(±s)

組別 caspase3 A組(n=10) 384245.33±17708.68 B組(n=10) 170955.93±12090.22 C組(n=10) 222563.57±16886.38 D組(n=10) 107102.38±14598.87

圖1 各組caspase3免疫組化圖片

央芪湯流浸膏可以顯著抑制SGC-7901在裸鼠皮下移植瘤抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)，與對(duì)照組相比，抑制率明顯提高(P<0.05)。與5-FU組相比，抑制率亦提高(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 央芪膏、氟尿嘧啶對(duì)SGC-7901裸鼠皮下移植瘤bcl-2的影響(±s)

表2 央芪膏、氟尿嘧啶對(duì)SGC-7901裸鼠皮下移植瘤bcl-2的影響(±s)

組別 Bcl-2 A組(n=10) 149071.26±24145.68 B組(n=10) 548097.68±30145.27 C組(n=10) 474247.66±28822.81 D組(n=10) 684670.14±33694.61

圖2 各組bcl-2免疫組化圖片

3 討論

3.1 胃癌與caspase3、Bcl-2的生物學(xué)特性關(guān)系 近年來，中醫(yī)藥在腫瘤的防治中發(fā)揮著重要的作用，尤其是中西醫(yī)結(jié)合治療惡性腫瘤能明顯提高腫瘤治療的療效，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。隨著高科技實(shí)驗(yàn)方法的滲透，中醫(yī)藥防治腫瘤的作用機(jī)制正逐漸被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究所揭示。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在胃上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化、潰瘍以及腫瘤形成、進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸中起著非常重要的作用。凋亡率可作為胃癌患者預(yù)后評(píng)估的一個(gè)重要指標(biāo)。目前普遍認(rèn)為，誘導(dǎo)凋亡是成功治療腫瘤的關(guān)鍵。Caspase是一組半胱天冬蛋白酶家族，其在細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用。Caspase3是已知該家族成員中執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶之一，被細(xì)胞外各種凋亡信號(hào)激活后，使胞質(zhì)、胞核及細(xì)胞骨架的重要蛋白酶失活，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。Caspase3是細(xì)胞凋亡途徑末端底物酶解的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白酶[2]，其表達(dá)意味著細(xì)胞死亡。探討Caspase3蛋白在胃癌發(fā)生過程中的作用有助于胃癌的防治。

Bcl-2蛋白家族是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，其主要功能是作為一個(gè)信號(hào)錨定序列，負(fù)責(zé)定位和插入到線粒體外膜，抑制細(xì)胞凋亡，是迄今研究最深入、最廣泛的凋亡調(diào)控基因之一。在前列腺癌、膀胱癌等中都有Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)[3]。Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的負(fù)性調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制上，這種結(jié)果將允許分裂細(xì)胞的累積和阻止帶有惡性潛能基因的改變，促進(jìn)癌變的發(fā)生[4-5]。

本實(shí)驗(yàn)中采用動(dòng)物皮下移植瘤模型，研究央芪湯流浸膏對(duì)胃癌組織凋亡的影響。通過檢測(cè)Bcl-2和Caspase3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)央芪湯流浸膏藥物組Caspase3增高，Bcl-2降低，結(jié)論符合凋亡檢測(cè)結(jié)果。央芪湯流浸膏可以提高胃癌細(xì)胞株SGC-7901在裸鼠皮下移植瘤的caspase-3蛋白表達(dá)，央芪湯流浸膏組和聯(lián)合組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。央芪湯流浸膏組與聯(lián)合組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。央芪湯流浸膏可以顯著抑制SGC-7901在裸鼠皮下移植瘤抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)，與對(duì)照組及 5-FU組相比，抑制率明顯提高。

3.2 央芪湯流浸膏治療胃癌的探討 中醫(yī)對(duì)胃癌的治療有著非常豐富的經(jīng)驗(yàn)，胃癌屬于祖國醫(yī)學(xué)“胃脘痛” “痞滿”“ 反胃”“呃逆”等范疇。胃為水谷之海，百物聚集之所，多氣多血之臟，飲食藥物，先傷于胃，物聚類雜，最易壅塞。故本病多系飲食不節(jié)，憂思過度而損傷脾胃；或外邪內(nèi)阻，致使清氣不升，濁氣不降，營氣不從，逆于肉里，日久腐蝕胃腑致胃失和降，脾胃升降功能失常，痰凝氣滯，交阻于胃，積聚成塊是胃癌的主要病因，正氣虧虛、臟腑功能失調(diào)是發(fā)病的內(nèi)在因素。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腫瘤是由于正氣虧虛、氣滯血瘀、邪毒積聚而成?！罢摲e自成”、“ 邪之所湊，其氣必虛”。中晚期胃癌患者大多正氣虛弱，免疫功能低下。在中晚期胃癌的治療中，化療在取得一定療效的同時(shí)，也對(duì)正常組織細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用，抑制機(jī)體的免疫功能和骨髓造血功能，此即所謂祛邪亦傷正，致使患者生活質(zhì)量低下，生存時(shí)間縮短。央芪湯由豬央央、黃芪、敗醬草、白及、白英、蒲公英等藥物組成。方中黃芪為補(bǔ)中益氣要藥，與黨參等補(bǔ)氣健脾藥物配伍，對(duì)脾氣虛弱、倦怠乏力者療效明顯。多項(xiàng)研究表明，黃芪對(duì)胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌等腫瘤均有明顯的抗癌作用，也可增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性[6]。黨參補(bǔ)氣之力較為平和，專注于補(bǔ)益脾肺之氣，且能補(bǔ)血，對(duì)胃癌患者常見的貧血能起到較好的治療作用。白花蛇舌草為苦寒之品，有較強(qiáng)的清熱解毒功效，用于治療熱毒所致的諸證，近年來常與豬央央、白英等清熱解毒之品廣泛用于各種癌癥的治療。

央芪湯作為傳統(tǒng)中藥，煎煮過程較為繁瑣，消化道腫瘤患者普遍存在的惡心嘔吐等癥也給口服用藥帶來了一定的麻煩。另外，中藥的口服給藥或注射給藥在時(shí)間-血藥濃度曲線上常出現(xiàn)“峰谷”現(xiàn)象。當(dāng)血藥濃度處于谷底時(shí)，難以充分發(fā)揮藥效，處于峰頂時(shí)，又會(huì)產(chǎn)生毒性。因此，探尋新的給藥方式顯得尤為重要。中藥敷貼療法是祖國醫(yī)學(xué)外治法中的瑰寶，以其安全、方便、減少給藥次數(shù)等而為患者所接受。在臨床各科中，其以較好的臨床療效受到了患者和醫(yī)家的喜愛。它不經(jīng)過肝臟的“首過效應(yīng)”，維持穩(wěn)定、持久的血藥濃度，降低了藥物的毒副作用。中藥敷貼療法屬于現(xiàn)代透皮給藥系統(tǒng)，是繼口服液、注射液之后制劑研究的新熱點(diǎn)，透皮貼劑已經(jīng)在多種藥物中成功開發(fā)。本項(xiàng)目研究通過將央芪湯制作成流浸膏敷貼制劑，改善藥物透過角質(zhì)層的穿透性，增強(qiáng)了療效。而且，從實(shí)驗(yàn)過程中可見，央芪湯流浸膏敷貼制劑對(duì)裸鼠的皮膚未造成損害，是一種安全、有效的治療方法。

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10.3969/j.issn.1674-4985.2012.24.009

2010武漢市衛(wèi)生局臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(編號(hào)：WZ10E03)

①武漢市中醫(yī)醫(yī)院 湖北 武漢 430014

②華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院

③華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院

孫易娜

2012-04-06) (本文編輯：陳丹云)