北五昧子藤莖三萜抗氧化活性研究

李 斌，李元甦，孟憲軍，薛 雪，朱力杰

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110161）

北五昧子藤莖三萜抗氧化活性研究

李 斌，李元甦，孟憲軍*，薛 雪，朱力杰

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110161）

利用乙醇浸提法從北五味子藤莖中提取三萜類化合物，再經(jīng)初步純化后，進(jìn)行三萜的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)。通過(guò)總還原力測(cè)定法、Fenton法、改良的鄰苯三酚自氧化法、DPPH法、豬油體系抗氧化法，分別對(duì)北五味子藤莖提取物的總還原力、羥自由基、超氧陰離子自由基及DPPH自由基的清除能力、過(guò)氧化值（POV值）進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，北五味子藤莖三萜有較好的還原能力；對(duì)羥自由基和DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用，且清除率50%所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度IC50分別為0.6mg/mL和0.077mg/mL，但對(duì)超氧陰離子自由基清除效果不是很顯著；有一定地抑制油脂氧化的作用但弱于抗壞血酸、TBHQ，抗壞血酸對(duì)三萜的抗氧化性有協(xié)同增效作用。

北五味子藤莖，三萜，抗氧化性

北五味子Schisandra chinensis（Turcz.）baill，木蘭科（magnoliaceae）五味子屬（schisandra michx.）植物，主要分布于遼寧、吉林、黑龍江等地的一種十分珍貴的藥材，以遼寧省所產(chǎn)質(zhì)量最佳，有“遼五味”之稱[1]。《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定其果實(shí)和種子，藤莖均可入藥。在國(guó)內(nèi)外一直被用作滋補(bǔ)強(qiáng)壯藥和收斂鎮(zhèn)咳藥[2-3]。三萜類化合物是近幾年天然產(chǎn)物開發(fā)的熱點(diǎn)，三萜及其苷類化合物在植物中分布廣泛，如靈芝三萜、人參三萜苷、黃芪三萜苷等[4-6]。據(jù)報(bào)道從五味子科植物中分到的一些三萜具有抗HIV[7]，抗腫瘤活性，抑制膽固醇生物合成的活性[8]和對(duì)白血病P-388細(xì)胞有抑制作用[9]。在五味子中發(fā)現(xiàn)三萜類化合物，目前僅限于南五味子[10]，而北五味子中三萜類化合物的提取及抗氧化活性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。在我國(guó)，其藤莖僅以調(diào)味品應(yīng)用，而目前科學(xué)研究對(duì)其藤莖的化學(xué)研究較少，僅有少量關(guān)于藤莖中木脂素含量的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇浸提法從北五味子藤莖中提取三萜類化合物，再經(jīng)初步純化后，進(jìn)行三萜的體外抗氧化作用的研究，為其藥用和深入開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北五味子藤莖 采自遼寧省撫順市新賓地區(qū)（粉碎過(guò)60目篩備用），撫順青松藥業(yè)提供；豬油 市售新鮮板油熬制；無(wú)水乙醇、30%雙氧水、三氯乙酸、六氰合鐵酸鉀、三氯化鐵、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、抗壞血酸、鄰苯三酚、鹽酸、碘化鉀、可溶性淀粉、硫代硫酸鈉、冰醋酸、三氯甲烷、重鉻酸鉀、三羥甲基氨基甲烷（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；TBHQ 廣州泰邦食品添加劑有限公司；DPPH（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl） SIGMA。

電熱恒溫水浴鍋、DZF-6050真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LG10-2.4高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 深圳市凱銘杰儀器有限公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 北五味子藤莖三萜樣品的制備

1.2.1.1 提取 通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到最佳提取工藝條件：液料比1∶29，乙醇濃度82%，水浴溫度54℃，時(shí)間1.3h。準(zhǔn)確稱取北五味子藤莖粉末20.0g，置于1000mL燒杯中，采用料液比1∶29（m/V）加82%的乙醇，在54℃恒溫水浴鍋中浸提1.3h。萃取后經(jīng)抽濾收集濾液，將濾液真空濃縮，即得總?cè)拼痔嵋骸?/p>

1.2.1.2 初步純化 總?cè)拼痔嵋航?jīng)AB-8大孔吸附樹脂初步純化，去除水不溶性雜質(zhì)，將純化液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至最小體積，真空干燥后，得到北五味子藤莖三萜樣品。

1.2.2 北五味子藤莖三萜的抗氧化性能實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 還原力的測(cè)定 將不同濃度（0.05、0.1、0.5、2、10mg/mL）三萜分別取2.5mL加入試管中，依次加入2.5mL 0.2mo1/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.6）和2.5mL 1%六氰合鐵酸鉀溶液[K3Fe（CN）6]，于50℃水浴保溫20min后，快速冷卻，再加入2.5mL 10%三氯乙酸，以3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸餾水，0.5mL 0.1%的三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10min后，在700nm處測(cè)定其吸光值（A，以蒸餾水作參比），吸光值越大表示還原力越強(qiáng)（實(shí)驗(yàn)中樣品均用蒸餾水溶解。以VC、VE作為有還原能力的陽(yáng)性對(duì)照，操作同上）[11-12]。

1.2.2.2 羥自由基清除活性的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)分為三組[13]：A0組（不含樣品和H2O2）、A1組（不含樣品，含H2O2）、AX樣品組（含不同濃度樣品和H2O2）。取1.5mmol/L鄰二氮菲溶液1.0mL，加pH7.4 0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液2.0mL，充分混勻后，加1.5mmol/L硫酸亞鐵溶液1.0mL，加入樣品溶液1.0mL，每加一管立即混勻，加0.01% H2O2溶液1.0mL。反應(yīng)在37℃恒溫水浴中進(jìn)行，準(zhǔn)確反應(yīng)1h后，在536nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。損傷組中用1.0mL去離子水代替樣品溶液；未損傷組中用2.0mL去離子水代替樣品溶液和H2O2溶液。

式中：AX：樣品組吸光度；A0：未損傷組吸光度；A1：損傷組吸光度。

1.2.2.3 O2-·清除作用的測(cè)定 鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定[14]：取兩只試管，加入pH8.0、2.99mL 50mmol/mL的Tris-HCl緩沖溶液，然后加人10μL 30mmol/L鄰苯三酚，空白管用10mmol/L HCl溶液代替鄰苯三酚，迅速搖勻，立即傾入1cm石英比色杯中，在325nm處測(cè)定光吸收值，從加入鄰苯三酚時(shí)開始計(jì)時(shí)每隔30s讀一次，測(cè)定4min內(nèi)每分鐘吸收值的變化，要求自氧化速率控制在每分鐘的吸收值為0.07。

式中：A1：第1min吸光度；A4：第4min吸光度。

樣品活性測(cè)定：樣品管中再加入鄰苯三酚，為消除色素影響，同時(shí)在空白管和樣品管中加入等量樣品液，其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定。

1.2.2.4 DPPH自由基清除作用的測(cè)定 分別取不同濃度的北五味子藤莖三萜溶液2mL及2mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液加入同一具塞試管中，搖勻后避光放置30min，以乙醇作參比，分別測(cè)定517nm處的吸光度AX。同時(shí)測(cè)定2mL不同濃度測(cè)定溶液與2mL乙醇混合后517nm的吸光度A2，再測(cè)定2mL DPPH溶液與2mL乙醇混合液517nm的吸光度A1[15]。將根據(jù)公式計(jì)算其抑制率，抗壞血酸作陽(yáng)性對(duì)照。

式中：AX：加測(cè)定溶液后DPPH·的吸光度；A2：測(cè)定溶液在測(cè)定波長(zhǎng)的吸光度；A1：未加測(cè)定溶液時(shí)DPPH·的吸光度。

1.2.2.5 北五味子藤莖三萜對(duì)豬油的抗氧化作用 北五味子藤莖三萜不同添加量的抗油脂氧化性能研究[16]：準(zhǔn)確稱取一定重量比例（0.02%、0.05%、0.1%）三萜及0.02%TBHQ，分別加入到50g豬油中，劇烈攪拌均勻。同時(shí)以不加添加物的油脂作空白。將所有樣品放置于烘箱中，用烘箱高溫誘導(dǎo)豬油發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，在60～70℃下加速氧化。每隔一定時(shí)間攪拌1次，并交換其在烘箱中的位置。每2d取出，按照GB5538-2005碘量法測(cè)定過(guò)氧化值（POV）。以POV大小表示油脂的氧化速度，進(jìn)而衡量抗氧化劑的活性。五組實(shí)驗(yàn)分別為：空白、0.02%、0.05%、0.1%三萜及0.02%TBHQ。

北五味子藤莖三萜與VC的協(xié)同抗氧化作用[17]：選用抗壞血酸為協(xié)同增效劑，與北五味子三萜在豬油中進(jìn)行協(xié)同抗氧化實(shí)驗(yàn)。五組實(shí)驗(yàn)分別為：空白、0.05% VC、0.02%三萜、0.02%三萜+0.05%VC、0.02%TBHQ。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原力的測(cè)定

圖1 北五味子藤莖三萜的還原力Fig.1 The reducing ability of triterpene from Schisandga Chinensis Baill

一般情況下，樣品的還原力與抗氧化活性有明顯的相關(guān)性。從圖1可以看出，在一定濃度范圍內(nèi)，北五味子藤莖三萜還原力隨其濃度的增加而增強(qiáng)，不同濃度之間北五味子藤莖三萜還原力差異顯著，在三萜濃度為0.5mg/mL時(shí)，還原能力已超過(guò)30μg/mL VC體系和2μg/mL VE體系。結(jié)果表明，北五味子藤莖三萜具有還原能力，是良好的電子供應(yīng)者，具有抗氧化活性的可能。

2.2 對(duì)·OH清除作用的測(cè)定

利用Fenton反應(yīng)，檢測(cè)北五味子藤莖三萜對(duì)羥自由基的清除作用，結(jié)果如圖2所示，北五味子藤莖三萜對(duì)羥自由基有一定的清除作用，作用效果與三萜濃度呈量效關(guān)系，清除率隨著三萜濃度得提高而增大。對(duì)照品VC對(duì)清除50%·OH所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度IC50為0.692mg/mL，而北五味子藤莖三萜的IC50為0.6mg/mL。

圖2 北五味子藤莖三萜和抗壞血酸對(duì)羥自由基清除能力Fig.2 The capability of triterpene from Schisandga Chinensis Baill and ascorbic acids on scavenging hydroxyl radicals

2.3 對(duì)O2-·清除作用的測(cè)定

利用改良的鄰苯三酚自氧化法，檢測(cè)北五味子藤莖三萜對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用，結(jié)果如圖3所示，北五味子藤莖三萜對(duì)鄰苯三酚自氧化均有一定的抑制作用，超氧陰離子自由基清除率隨北五味子藤莖三萜濃度的增加而升高，但清除O2-·的能力低于對(duì)照品VC。對(duì)照品VC對(duì)清除50%O2-·所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度IC50為0.284mg/mL，而北五味子藤莖三萜的IC50為105.676mg/mL（以樣品濃度與清除率作圖，根據(jù)擬合方程求出清除率為50%所需樣品的濃度，即半抑制濃度IC50）。

圖3 北五味子藤莖三萜和抗壞血酸對(duì)超氧陰離子自由基清除能力Fig.3 The capability of triterpene from Schisandga Chinensis Baill and ascorbic acids on scavenging superoxide anion radicals

2.4 對(duì)DPPH自由基清除作用的測(cè)定

DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，當(dāng)有自由基清除劑存在，由于其單電子配對(duì)而使其顏色由深紫色褪至黃色，其褪色程度與自由基清除能力存在一定的關(guān)系，褪色程度越明顯，清除能力越強(qiáng)。結(jié)果如圖4所示，三萜對(duì)DPPH自由基的清除能力與加入三萜的濃度相關(guān)，加入量越大，清除能力越強(qiáng)。對(duì)照品VC對(duì)清除50%DPPH·所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度IC50為0.116mg/mL，而北五味子藤莖三萜的IC50為0.077mg/mL。

圖4 北五味子藤莖三萜和抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.4 The scavenging effect of triterpene from Schisandga Chinensis Baill and ascorbic acids on DPPH·

2.5 北五味子藤莖三萜不同添加量在豬油中抗氧化效果

實(shí)驗(yàn)以抗氧化劑TBHQ為對(duì)比組，不加任何氧化劑的空白豬油為對(duì)照組，通過(guò)烘箱強(qiáng)化氧化檢測(cè)抗氧化劑對(duì)豬油氧化的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，所有實(shí)驗(yàn)組的POV值均低于空白對(duì)照組的值，說(shuō)明北五味子藤莖三萜對(duì)油脂有一定的抗氧化作用。隨著三萜添加量的增加，其對(duì)豬油的抗氧化作用增強(qiáng)，但抗油脂氧化性能不如TBHQ。

圖5 不同北五味子藤莖三萜添加量抗油脂氧化性能Fig.5 Antioxidative activity of different adding amount of triterpene from Schisandga Chinensis Baill

由圖6可知，抗壞血酸與北五味子藤莖三萜在豬油中的抗氧化活性有明顯的協(xié)同作用。當(dāng)0.02%的三萜與0.05%VC混合后其抗氧化能力最佳，這對(duì)于減少合成抗氧化劑的使用量從而減少由此帶來(lái)的毒副作用具有重要的實(shí)際意義。

圖6 三萜與抗壞血酸混合使用抗氧化性能的比較Fig.6 Comparison of antioxidative activity of triterpene mixed with ascorbic acids

3 結(jié)論

北五味子藤莖三萜具有還原能力，當(dāng)三萜濃度為0.5mg/mL時(shí)，還原能力已超過(guò)30μg/mL VC體系和2μg/mL VE體系；對(duì)·OH和DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用，清除率隨其質(zhì)量濃度的增加而提高，且清除率50%所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度IC50分別為0.6mg/mL和0.077mg/mL；對(duì)鄰苯三酚自氧化均有一定的抑制作用，超氧陰離子自由基清除率隨質(zhì)量濃度的增加而升高，但清除O2-·的能力低于對(duì)照品VC，北五味子藤莖三萜的IC50為105.676mg/mL；有一定的抑制油脂氧化的作用但弱于抗壞血酸、TBHQ，抗壞血酸對(duì)三萜的抗氧化性有協(xié)同增效作用。

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Study on antioxidant activity of triterpenes from caculis of Schisandra Chinensis（Turcz.）baill

LI Bin，LI Yuan-su，MENG Xian-jun*，XUE Xue，ZHU Li-jie
（College of Food，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China）

By means of ethanol extraction，triterpenes was extracted from caculis of Schisandra Chinensis（Turcz.）baill.After initial purification，antioxidative activities of the triterpenes were experimented.The antioxidative activities of ethanol extracts were evaluated using various established in vitro systems，including total reducing power，superoxide/hydroxyl/DPPH radical-scavenging assays and the POV value.The experimental results showed that triterpenes had better reducing power，stronger antioxidation effect on the·OH and DPPH·，and the quality concentration 50%（IC50）was 0.6mg/mL and 0.077mg/mL to inhibit.It had less effect on inhibiting O2-·.Triterpenes could inhibit peroxidation of lard，and have less effect of lard peroxidation than VCand TBHQ.Triterpenes exhibited remarkable synergistic antioxidation activity in lard by adding VC.

caculis of Schisandra Chinensis（Turcz.）baill；triterpenes；antioxidative activities

TS201.1

A

1002-0306（2012）03-0121-04

2010－12－31 *通訊聯(lián)系人

李斌（1979-），男，博士，主任，主要從事功能食品的活性成分提取方面研究。

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)青年教師基金（20101007）；遼寧省教育廳科研研究一般項(xiàng)目（2011）。