大豆抗癌肽的分離純化及分子量分布

葛錫娟，趙城彬，楊麗麗，吳 非

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

大豆抗癌肽的分離純化及分子量分布

葛錫娟，趙城彬，楊麗麗，吳 非*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

為確定具有抗癌活性大豆多肽的分子量，對(duì)大豆抗癌肽粗提物進(jìn)行超濾，采用MTT法（四噻唑藍(lán)比色法）對(duì)得到的不同組分超濾液進(jìn)行抗癌活性檢測(cè)，初步確定分子量在5000～10000u范圍的組分具有最高的抑癌活性，大豆抗癌肽的IC50為0.47mg/mL。用葡聚糖Sephadex G-75凝膠柱對(duì)該組分進(jìn)行進(jìn)一步分離，收集各洗脫組分并進(jìn)行抗癌活性研究。結(jié)果顯示：組分A4具有最佳的抗癌活性，其IC50為0.37mg/mL。根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其平均相對(duì)分子質(zhì)量為6723u。

大豆多肽，抗癌活性，凝膠過(guò)濾，相對(duì)分子量

抗癌活性肽（anti-cancer bioactive peptide，ACBP）最早是蘇秀蘭等從山羊臟器中提取的一種低分子活性物質(zhì)[1]。大豆抗癌肽是一類具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、對(duì)化療藥物有增敏作用等的大豆多肽。Ben O deLumen等[2]、Hyung等[3]研究顯示，大豆中含有一種新型的預(yù)防癌癥的物質(zhì)Lunasin，通過(guò)抑制核心組蛋白乙?；瘡亩鸢┘?xì)胞凋亡，這對(duì)抑制癌細(xì)胞發(fā)展和轉(zhuǎn)移都有重要意義。國(guó)內(nèi)對(duì)大豆多肽的研究主要集中在抗氧化性、抗高血壓性、降血脂和降膽固醇方面[4-6]，有關(guān)大豆中抗癌肽的研究較少。具有抗癌活性的大豆多肽分子量分布也未見(jiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)以胃癌SGC7901細(xì)胞增殖抑制率為檢測(cè)指標(biāo)，先將大豆粗提物進(jìn)行超濾，采用MTT法對(duì)不同分子量范圍超濾液的抗癌活性進(jìn)行研究。將有最佳抗癌活性的超濾組分用葡聚糖Sephadex G-75凝膠層析進(jìn)行進(jìn)一步的分離，收集各洗脫組分進(jìn)行抗癌活性檢測(cè)，確定具有最佳抗癌活性的洗脫組分。通過(guò)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大豆抗癌肽的分子量。以期為大豆抗癌肽在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為下一步制備特定功能的大豆多肽奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 市售；人胃癌細(xì)胞SGC7901 博士得試劑公司；葡聚糖凝膠G-75 美國(guó)GE公司；RPMI1640 上海索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清（FBS） 杭州四季青生物工程材料有限公司，使用前56℃滅活30min，4℃保存；胰蛋白酶（Typein，1∶250），溶于上述0.01mol/L的PBS，濃度為0.25%，過(guò)濾除菌，-20℃冰箱保存、噻唑藍(lán)（MTT，3（4，5-dimethylthiazo2-yl）2，5-diphenyltetrazolium Bromide），溶于上述0.01mol/L的PBS，濃度為5mg/mL，過(guò)濾除菌，4℃冰箱避光保存 美國(guó)Amresco公司。

酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 美國(guó)BIO-RAD；超濾裝置（超濾膜截留分子量分別為10000、5000u，型號(hào)分別為CLS-K-I-A10000，CLS-K-I-A5000） 北京中科膜技術(shù)有限公司；AKTA explorer蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；Frac-950收集器；LGJ-1冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用離心機(jī)廠；IMT-413倒置熒光顯微鏡 日本OLYMPUS；超聲波震蕩儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所；CO2培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；pHS-3C型pH計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠；1000μL微量進(jìn)樣器等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆抗癌肽的提取 干燥的大豆1kg粉碎后，用乙醚進(jìn)行脫脂，脫脂粉烘干過(guò)80目篩。取3g脫脂大豆粉，加入PBS緩沖溶液15mL（pH7.4），40℃條件下超聲波處理80min，每隔10min攪拌一次。將處理后的溶液使用截留分子量為1000u的透析膜對(duì)粗提物水溶液進(jìn)行透析（4℃，24h），除去鹽、少量有機(jī)溶劑及生物小分子雜質(zhì)等。將透析液取出離心（20000×g，30min，4℃），轉(zhuǎn)移上清液，備用。

1.2.2 大豆抗癌肽的分離純化

1.2.2.1 超濾分離粗品大豆抗癌肽 將上述制得的大豆抗癌肽粗提液過(guò)截留分子量為5000u的超濾膜，再將其透過(guò)液過(guò)截留分子量為10000u的超濾膜。分別獲得分子量在gt;10000、5000～10000、lt;5000u三個(gè)組分。收集各組分多肽液進(jìn)行冷凍干燥，通過(guò)計(jì)算各組分的IC50，初步確定具有抗癌活性的大豆多肽分子量范圍。

1.2.2.2 凝膠層析分離純化大豆抗癌肽 將Sephadex G-75凝膠用蒸餾水浸泡24h以上，裝柱。取1.2.2.1中具有最高抑癌率組分凍干粉0.1g溶于10mL緩沖液，進(jìn)行層析分離。分離條件是上樣量0.5mL，流速為0.5mL/min，洗脫液為0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4，室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。用部分收集器收集多肽洗脫峰，收集量3mL/管。對(duì)各洗脫峰分別進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，計(jì)算抑癌率。

1.2.3 大豆抗癌肽分子量分布的初步測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將分子量已知的標(biāo)準(zhǔn)品a牛血清白蛋白（分子量66000）、b卵白蛋白（分子量44000）、c胰蛋白酶（分子量21000）、d溶菌酶（分子量14000）和e胰島素（分子量5500）分別稱取20mg溶解于3mL pH為8的磷酸鹽緩沖溶液中溶解，制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。

將已處理好的交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex G-75）裝柱，用洗脫液洗脫至基線平穩(wěn)。五種配制好的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合振蕩均勻后，抽取混合液1mL上樣，在280nm分別檢測(cè)蛋白質(zhì)吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品分子量對(duì)數(shù)與保留時(shí)間關(guān)系建立線性方程，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 大豆抗癌肽分子量的計(jì)算 按照體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算并比較各組分抑癌率大小，確定大豆抗癌肽出峰時(shí)間。通過(guò)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算大豆抗癌肽的分子量。

1.2.4 抗癌活性測(cè)定-MTT法 將對(duì)數(shù)成長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞SGC7901用1mL 0.25%的胰蛋白酶消化。待細(xì)胞變圓后吸出胰蛋白酶。用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液（pH7.4）沖洗分散細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔4000～5000個(gè)/200μL細(xì)胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μL。將培養(yǎng)板移入5%CO2，37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將經(jīng)分離純化的大豆抗癌肽溶液過(guò)0.22μm濾膜除菌，每孔分別加入濾液100μL，同時(shí)設(shè)置5個(gè)平行孔。并設(shè)陰性對(duì)照組（含同一細(xì)胞密度的培養(yǎng)液）和溶劑對(duì)照組（200μL RPMI1640培養(yǎng)液）。加完后繼續(xù)孵育48h后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，37℃，繼續(xù)孵育4h后，每孔加入150μL DMSO，輕輕振蕩15min，使藍(lán)紫色甲瓉結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值（OD490），記錄結(jié)果。按下列公式求出生長(zhǎng)抑制率（IR）和半數(shù)致死濃度IC50。

IC50=細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為50%的藥物質(zhì)量濃度。

根據(jù)計(jì)算出的IR值按以下標(biāo)準(zhǔn)判斷提取物的敏感性：IRgt;50%，高度敏感；30%≤IR≤50%，敏感；IRlt; 30%，不敏感；采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行結(jié)果分析。1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0分析處理數(shù)據(jù)，用Probit、ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾分離大豆抗癌肽

實(shí)驗(yàn)以對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901的生長(zhǎng)抑制作用作為反映抗癌活性的指標(biāo)，通過(guò)初次篩選，發(fā)現(xiàn)大豆粗提物對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨加樣濃度升高而升高，最高抑制率分別為44.84%、69.34%、50.32%（見(jiàn)表1）。

根據(jù)IC50的定義，采用SPSS的Probit計(jì)算得分子量小于5000u、5000～10000u、大于10000u三種組分的IC50值分別為1.17、0.47、0.96mg/mL。比較各組分半數(shù)致死濃度（IC50）值可知，分子量在5000～10000u的組分對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用最佳，此時(shí)的IC50≈0.47mg/mL。因此，初步確定大豆抗癌肽的分子量范圍在5000～10000u。

表1 大豆粗提物超濾后各組分癌細(xì)胞抑制率（±s）和IC50值Table 1 Cancer cell inhibition rate of soybean extract components after ultrafiltration（±s）and IC50value

表1 大豆粗提物超濾后各組分癌細(xì)胞抑制率（±s）和IC50值Table 1 Cancer cell inhibition rate of soybean extract components after ultrafiltration（±s）and IC50value

組分（mg/mL） gt;10ku 5～10ku ＜5ku細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%） IC50（mg/mL） 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%） IC50（mg/mL） 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%） IC50（mg/mL）0.1 4.08±3.09 17.58±4.442 12.02±5.45 0.2 28.46±4.81 37.59±6.87 18.69±7.07 0.4 26.26±5.80 1.17 41.12±10.36 0.47 26.28±8.58 0.96 0.6 29.56±1.91 58.78±9.53 39.11±4.54 0.8 44.84±2.31 69.34±6.49 50.32±7.02

2.2 凝膠層析分離純化大豆抗癌肽結(jié)果

對(duì)經(jīng)超濾得到的相對(duì)分子質(zhì)量在5000～10000u的多肽液進(jìn)行Sephadex G-75柱層析分離，分別收集洗脫峰并編號(hào)A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10（見(jiàn)圖1），經(jīng)過(guò)多次分離收集樣品并凍干。將收集的各組分配成濃度為0.1mg/mL溶液，進(jìn)行抗癌活性檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 大豆抗癌肽的SephadexG-75凝膠洗脫圖譜Fig.1 SephadexG-75 gel elution profile of soybean anticancer peptide

表2 各洗脫組分的OD值和癌細(xì)胞抑制率（±s）Table 2 OD value and cancer cell inhibition rate of each eluted fractions（±s）

表2 各洗脫組分的OD值和癌細(xì)胞抑制率（±s）Table 2 OD value and cancer cell inhibition rate of each eluted fractions（±s）

組別 OD值 生長(zhǎng)抑制率（%）空白組 0.136±0.052對(duì)照組 0.324±0.016 A1 0.293±0.015 16.57±7.68 A2 0.322±0.008 1.17±5.67 A3 0.276±0.021 25.50±6.57 A4 0.262±0.012 33.15±9.01 A5 0.272±0.018 27.73±8.06 A6 0.315±0.014 5.10±3.41 A7 0.294±0.017 16.25±8.03 A8 0.312±0.015 6.37±5.76 A9 0.281±0.20 23.16±9.31 A10 0.321±0.011 2.02±6.86

由表2可知，組分A1～A10中，A4的抗癌活性最高，生長(zhǎng)抑制率IR=33.15%＞30%，具有敏感的抗癌性。其次是組分A5，它的生長(zhǎng)抑制率IR=27.73%＜30%，因此對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制不敏感?？拱┗钚宰畹偷氖墙M分A2，抑癌率只有1.17%。各組分的抗癌活性依次為A4＞A5＞A3＞A9＞A1＞A7＞A8＞A6＞A10＞A2。將A4組分配成不同濃度（0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL）的溶液，根據(jù)細(xì)胞抑制率（17.58%、20.96%、30.59%、35.67%、40.2%、46.7%、45.5%、44.4%、56.3%）計(jì)算其IC50為0.37mg/mL。明顯優(yōu)于超濾后的抗癌肽組分（IC50≈0.47mg/mL），說(shuō)明純化效果較好。

由于肽結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，其抗癌機(jī)理也比較復(fù)雜。肽的抗癌活性一方面與其特定的氨基酸組成有關(guān)；另一方面還與其氨基酸序列有密切聯(lián)系。如Lunasin，其抗癌作用是因?yàn)樵谒腃-末端有8個(gè)天冬氨酸殘基，當(dāng)它們結(jié)合到核染色質(zhì)區(qū)域后（比如出現(xiàn)在著絲點(diǎn)），它們對(duì)抗有絲分裂效應(yīng)起到很大的作用。結(jié)果，著絲點(diǎn)處復(fù)合物不能正常形成，微管不能連到著絲點(diǎn)上，導(dǎo)致有絲分裂停止，細(xì)胞最終死亡，從而起到抑制癌細(xì)胞增殖的作用[7]。

2.3 大豆抗癌肽分子量的測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按上述分離方法測(cè)定各已知分子量標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間，記錄蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收峰出現(xiàn)時(shí)的保留時(shí)間（min），測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的SephadexG-75凝膠洗脫圖譜Fig.2 SephadexG-75 gel elution profile of protein standard

以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，以lgM為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3。

圖3 分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Molecular weight standard curve

由圖3可見(jiàn)，分子量對(duì)數(shù)與保留時(shí)間呈線性關(guān)系，回歸方程為Y=-0.0817x+6.4632，R2=0.988。式中，X代表保留時(shí)間，Y代表分子量對(duì)數(shù)，0.988為標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)。由此可知，各分子量的對(duì)數(shù)值與各標(biāo)樣的保留時(shí)間具有良好的線性關(guān)系，可以準(zhǔn)確地根據(jù)此回歸方程計(jì)算出提取物中抗癌肽分子量分布。

2.3.2 大豆抗癌肽分子量的確定 大豆抗癌肽粗品經(jīng)Sephadex G-75凝膠過(guò)濾分離結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，提取物有三個(gè)明顯的洗脫峰A4、A5、A9，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，組分A4具有較佳的抑癌性。這三個(gè)洗脫峰的保留時(shí)間分別為32.26、47.06、80.27min，其中A9分子量較小主要是一些鹽類。根據(jù)回歸方程計(jì)算得A4、A5的平均分子量分別為6723u和420u。根據(jù)各組分的癌細(xì)胞抑制率可知，經(jīng)過(guò)分離純化后大豆抗癌肽的平均相對(duì)分子質(zhì)量為6723u。

國(guó)外有關(guān)大豆抗癌肽及相關(guān)的報(bào)道中，介紹一種全新的大豆抗癌肽Lunasin可以抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞核心組蛋白的乙?；Ｆ滢卓够瘜W(xué)誘癌物和致癌基因的功效已在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和一種皮膚癌小鼠模型上得到證實(shí)。盡管具有癌癥預(yù)防特性，Lunasin并不影響正常細(xì)胞和已確立癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)。目前認(rèn)為其作用的后生性機(jī)制為，Lunasin通過(guò)與細(xì)胞轉(zhuǎn)化事件中暴露出的脫乙?；暮诵慕M蛋白的結(jié)合，破壞組蛋白乙?；?脫乙?；膭?dòng)力學(xué)過(guò)程并導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而選擇性地殺死正在轉(zhuǎn)化或者新近轉(zhuǎn)化的細(xì)胞[8]。Lunasin是從大豆中分離和定性的，在所分析的美國(guó)各種基因型大豆中均有發(fā)現(xiàn)[9]。體外抑癌實(shí)驗(yàn)顯示，國(guó)產(chǎn)大豆中提取的抗癌肽對(duì)癌細(xì)胞也有一定的抑制作用。另外，研究表明Lunasin分子量小于8ku，而本實(shí)驗(yàn)提取的大豆平均相對(duì)分子質(zhì)量為6723u，所以該抗癌肽有可能是Lunasin，但實(shí)驗(yàn)中所做僅是初步觀察，仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)探討。

3 結(jié)論

近年來(lái)對(duì)大豆多肽類物質(zhì)研究較多的是它的抗氧化性，然而對(duì)大豆多肽的抗癌活性較少報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大豆多肽分子量在5000～10000u時(shí)具有最高的抑癌活性，此時(shí)，大豆抗癌肽的IC50為0.47mg/mL。樣品經(jīng)凝膠過(guò)濾分離純化后，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：組分A4具有最佳抗癌活性，IC50為0.37mg/mL；在0.1mg/mL濃度下，其IR值為33.15%＞30%，具有敏感的抗癌性；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大豆抗癌肽的平均相對(duì)分子質(zhì)量為6723u。

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Purification and distribution of molecular weight of soybean anti-cancer peptides

GE Xi-juan，ZHAO Cheng-bin，YANG Li-li，WU Fei*
（College of Food Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

To determine the molecular weight of soybean peptides with anti-cancer activity，the extraction of soybean anti-cancer peptides was ultrafiltrated.MTT（thiazole blue four）assay was used to detect the anticancer activity of different components obtained by ultrafiltration.Components of soybean anti-cancer peptides with molecular weight ranging from 5000 to 10000u had the highest anti-cancer activity，and the IC50of soy anti-cancer peptides was 0.47mg/mL.Gel Filtration Chromatography（Sephadex G-75）was applied to further separate and collect all of fractions in order to research the anti-cancer activity.The results showed that：A4 components had the best anti-cancer activity，and its IC50was 0.37mg/mL.According to standard curve of molecular weight，average molecular weight of A4 was about 6723u.

soybean peptides；anti-cancer activity；gel filtration；relative molecular weight

TS201.2+3

A

1002-0306（2012）03-0099-04

2011－02－21 *通訊聯(lián)系人

葛錫娟（1985-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

黑龍江省攻關(guān)項(xiàng)目（GA09B401-2）；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才基金項(xiàng)目（2008RFQXN016）。