谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對(duì)堿溶酸沉法提取南極磷蝦(EUPHAUSIA SUPERBA)蛋白質(zhì)得率的影響

王靈昭，薛長(zhǎng)湖，王玉明，薛 勇

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003；2.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇連云港222005）

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對(duì)堿溶酸沉法提取南極磷蝦(EUPHAUSIA SUPERBA)蛋白質(zhì)得率的影響

王靈昭1，2，薛長(zhǎng)湖1，*，王玉明1，薛 勇1

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003；2.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇連云港222005）

通過(guò)堿溶酸沉法提取了南極磷蝦蛋白質(zhì)，研究了谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響。結(jié)果表明：堿溶酸沉法能夠較好地回收南極磷蝦蛋白質(zhì)；在酸沉過(guò)程中，合理添加谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶能夠提高蛋白質(zhì)得率約5%。

南極磷蝦，蛋白質(zhì)得率，堿溶酸沉法，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶

南極磷蝦（Euphausia superba）總生物量和總后期幼體的年產(chǎn)量分別是1.17～3.79億t和3.42～5.36億t[1]。根據(jù)2004年FAO的報(bào)道，2000年以來(lái)全球包括野生和養(yǎng)殖所有漁業(yè)的年捕獲量約為1.3億t[2]。因此，作為人類潛在的食品，南極磷蝦的資源量非常巨大。南極磷蝦含有水分77.9%～83.1%，脂質(zhì)0.4%～3.6%，蛋白質(zhì)11.9%～15.4%，殼聚糖2%[3]。因此，南極磷蝦的開(kāi)發(fā)，尤其是其作為食品蛋白源的開(kāi)發(fā)應(yīng)被充分重視。堿溶酸沉法已被成功地用于植物蛋白，尤其是大豆蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。近年來(lái)，堿溶酸沉法被應(yīng)用于魚(yú)蛋白的提取，和魚(yú)糜加工相比，其顯著提高了蛋白質(zhì)的回收率[4－5]。因此，堿溶酸沉法提取南極磷蝦蛋白質(zhì)具有易工業(yè)化的可能，值得進(jìn)行研究。但是，南極磷蝦的消化道內(nèi)含有大量的自溶酶，包括蛋白酶、羧肽酶、核酶和磷脂酶[6]，其蛋白自溶酶可以快速、完全地降解各種蛋白質(zhì)[7]。南極磷蝦死后，由于體內(nèi)酶抑制系統(tǒng)活性減弱，磷蝦酶極易使其自溶。除強(qiáng)大的蛋白自溶酶外，南極磷蝦還含有相對(duì)較高的水溶性蛋白[8]。這些因素對(duì)堿溶酸沉法提取南極磷蝦蛋白都是不利的。本文研究了堿溶酸沉法提取南極磷蝦蛋白質(zhì)的得率，以及提取過(guò)程中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用對(duì)得率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

體長(zhǎng)約2.5～5cm的整只冷凍南極磷蝦蝦磚（Euphausia superba） 由日本水產(chǎn)株氏會(huì)社提供，在－30℃低溫冷庫(kù)中經(jīng)錘式粉碎機(jī)冷凍粉碎后置－30℃低溫下貯藏備用；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（酶活力100U/g） 泰州一鳴精細(xì)化工有限公司；其它生化試劑 均為分析純。

YTPCZ密封錘式粉碎機(jī) 鶴壁市英泰電子電器有限公司；FE20K梅特勒－托利多酸度計(jì) 瑞士梅特勒－托利多集團(tuán)；T18 ULTRA－TURRAX高速分散機(jī) 德國(guó)IKA集團(tuán)；LCB200低溫循環(huán)槽 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；TDL－5－A低速大容量多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；ALPHA 1－4 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)CHRIST集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南極磷蝦蛋白質(zhì)的提取 冷凍粉碎磷蝦和蒸餾水按1/6（M/V，g/mL）的比例攪拌混合，混合物用Ultra－Turrax勻漿機(jī)勻漿（4檔，1min），調(diào)節(jié)pH11.5，攪拌浸提（4℃，30min），將堿提液離心（4500r/min，10min）得液相A和沉淀A。沉淀A加入其質(zhì)量3倍體積的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH11.5，攪拌浸提（4℃，30min），將堿提液離心（4500r/min，10min）得液相B。合并液相A和液相B，得液相C。調(diào)節(jié)液相C至pH4.6，4℃靜置反應(yīng)30min，離心（4500r/min，10min），得液相D和沉淀D，沉淀D即為南極磷蝦蛋白質(zhì)。測(cè)定液相D的體積和蛋白質(zhì)含量。將沉淀D完全轉(zhuǎn)移至平面皿，真空冷凍干燥之后測(cè)定：質(zhì)量，蛋白質(zhì)含量，水分含量。計(jì)算南極磷蝦蛋白質(zhì)得率Y1（式1）和液相D中蛋白質(zhì)比率Y2（式2）。

1.2.2 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響 根據(jù)1.2.1的方法得液相C。對(duì)液相C進(jìn)行酸沉，在酸沉的過(guò)程中按以下三種途徑加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（酶活力100U/g），考察谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響。

途徑一：取一定體積的液相C，調(diào)節(jié)至pH4.6，分別加入不同量的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（0.1、0.3、0.5g/100mL），恒溫?fù)u床水?。?5℃，1h），離心（4500r/min，10min），得液相D和沉淀D。

途徑二：取一定體積的液相C，調(diào)節(jié)pH6.0，分別加入不同量的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（0.1、0.3、0.5g/100mL），恒溫?fù)u床水?。?5℃，1h），用2mol/L HCl調(diào)節(jié)酸沉至pH4.6，離心（4500r/min，10min），得液相D和沉淀D。

途徑三：取一定體積的液相C，調(diào)節(jié)pH6.0，分別加入不同量的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（0.1、0.3、0.5g/100mL），恒溫?fù)u床水?。?5℃，1h），離心（4500r/min，10min），得液相D和沉淀D。

分別測(cè)定液相D的體積和蛋白質(zhì)含量；分別將沉淀D完全轉(zhuǎn)移至平面皿，真空冷凍干燥之后測(cè)定：質(zhì)量，蛋白質(zhì)含量，水分含量。分別計(jì)算南極磷蝦蛋白質(zhì)得率Y1（式1）和液相D中蛋白質(zhì)比率Y2（式2）。

1.2.3 化學(xué)分析和數(shù)據(jù)分析 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定執(zhí)行凱氏定氮法；水分含量的測(cè)定執(zhí)行105℃恒重法。采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 南極磷蝦蛋白質(zhì)的提取

由表1可知，南極磷蝦蛋白質(zhì)得率為57.68%。魚(yú)糜加工是回收魚(yú)肉蛋白的傳統(tǒng)方式，但是通過(guò)傳統(tǒng)的魚(yú)糜加工工藝，100kg原料魚(yú)大約能夠得到19.5kg魚(yú)糜[9]，大量的魚(yú)肉蛋白隨著漂洗工序流失，其蛋白質(zhì)回收率低。此外，除強(qiáng)大的蛋白自溶酶外，南極磷蝦還含有相對(duì)較高的水溶性蛋白[8]。因此，目前魚(yú)糜加工工藝沒(méi)有成功應(yīng)用于南極磷蝦蛋白質(zhì)的回收。文獻(xiàn)[10]報(bào)道，采用等電點(diǎn)沉淀法從整只南極磷蝦中提取磷蝦蛋白濃縮物時(shí)蛋白質(zhì)得率為原料干基的45%～50%。因此，57.68%的得率說(shuō)明本研究的堿溶酸沉法能夠較好地回收南極磷蝦蛋白質(zhì)。文獻(xiàn)[10]和本研究中蛋白質(zhì)得率的差異在于提取工藝和計(jì)算方法的不同。

表1 南極磷蝦蛋白質(zhì)提取結(jié)果（±s，n=3）Table 1 Antarctic krill protein extraction results（±s，n=3）

表1 南極磷蝦蛋白質(zhì)提取結(jié)果（±s，n=3）Table 1 Antarctic krill protein extraction results（±s，n=3）

項(xiàng)目 Y1（%） Y2（%）指標(biāo)值 57.68±0.82 38.44±0.38

由表1可知，液相D中蛋白質(zhì)比率為38.44%，即酸沉?xí)r原料中38.44%的蛋白質(zhì)不能夠被沉淀回收。目前的研究表明，南極磷蝦蛋白酶主要包括8種蛋白自溶酶：TLⅠ、TLⅡ、TLⅢ、CL、CPAⅠ和CPAⅡ。CPBⅠ和CPBⅡ、TLⅠ具有外切酶和內(nèi)切酶的活性，而TLⅡ和Ⅲ只具有內(nèi)切酶活性[11]，CPA和CPB具有外切酶活性[12]。由于南極大磷蝦體內(nèi)的內(nèi)肽酶和外肽酶的比例適宜，因此，可以快速、完全地降解各種蛋白質(zhì)[7]。此外，磷蝦自溶酶的一個(gè)顯著特性是在0℃以下仍然能夠水解蛋白[13]。本研究采用的原料是冷凍南極磷蝦死體，因此由于南極磷蝦蛋白自溶酶在其貯運(yùn)過(guò)程中的自溶作用和含有較高的水溶性蛋白，使得酸沉過(guò)程中部分蛋白質(zhì)的分子量較小或等電點(diǎn)偏離pH4.6而在離心的過(guò)程中不足以被沉淀回收。

2.2 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TGase）是一種催化酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，它能使蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與氨基酸之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成ε－（γ－谷氨酰）賴氨酸鍵，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)[14]。因此，根據(jù)2.1的分析，推測(cè)在酸沉的過(guò)程中添加TGase可以使得液相D中不能被沉淀回收的部分小分子蛋白質(zhì)和肽由于受TGase作用，分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，分子量變大，功能性質(zhì)改變，從而在pH4.6酸沉反應(yīng)之后可以被離心回收，提高蛋白質(zhì)得率。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明，本研究采用的TGase對(duì)蛋白質(zhì)作用的適宜條件為pH6.0，35℃，1h；根據(jù)前期研究，南極磷蝦蛋白最適酸沉pH為4.6（數(shù)據(jù)未列出）。因此，在酸沉的過(guò)程中，本研究設(shè)計(jì)了三條不同的途徑（參見(jiàn)1.2.2）添加TGase，考察其對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別參見(jiàn)表2、表3和表4。

由表2可知，隨著TGase添加量的增加，和空白相比，Y2有不同程度的減小，Y1有不同程度的增加，說(shuō)明途徑一的方法能夠提高蛋白質(zhì)得率。當(dāng)TGase添加量為0.5g/100mL時(shí)，Y2約減小5%，由于TGase的主成分也是蛋白質(zhì)，不排除此時(shí)液相D中溶有少許來(lái)自TGase的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的得率至少提高5%；當(dāng)TGase添加量為0.5g/100mL時(shí)，Y1約增加10%，說(shuō)明蛋白質(zhì)得率的提高是因?yàn)門Gase的作用，并且由于部分TGase參與了反應(yīng)，使得其也被沉淀回收。雖然隨著TGase添加量的增加，蛋白質(zhì)得率增加，但是沉淀蛋白質(zhì)中引入TGase的量也增加，此外TGase添加量會(huì)使得經(jīng)濟(jì)成本增加，因此認(rèn)為TGase添加量不宜過(guò)大。

表2 途徑一中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響（±s，n=3）Table 2 Effect of application of transglutaminase on protein yield in method 1（±s，n=3）

表2 途徑一中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響（±s，n=3）Table 2 Effect of application of transglutaminase on protein yield in method 1（±s，n=3）

添加量（g/100mL） Y1（%） Y2（%）空白 57.68±0.82 38.44±0.38 0.5 68.18±0.92 33.38±0.26 0.3 62.74±0.79 34.60±0.28 0.1 57.83±0.66 35.82±0.34

表3 途徑二中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響（±s，n=3）Table 3 Effect of application of transglutaminase on protein yield in method 2（±s，n=3）

表3 途徑二中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響（±s，n=3）Table 3 Effect of application of transglutaminase on protein yield in method 2（±s，n=3）

添加量（g/100mL） Y1（%） Y2（%）空白 57.68±0.82 38.44±0.38 0.5 61.64±0.86 41.48±0.41 0.3 61.64±0.78 41.48±0.36 0.1 51.52±0.74 45.22±0.32

由表3可知，隨著TGase添加量的增加，和空白相比，Y2和Y1均有不同程度的增加。因?yàn)閅2的增加，所以認(rèn)為途徑二的方法在提高蛋白質(zhì)得率方面不可行。Y1的增加，推測(cè)其原因是在酸沉的過(guò)程中部分TGase被沉淀回收。

表4 途徑三中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響（±s，n=3）Table 4 Effect of application of transglutaminase on protein yield in method 3（±s，n=3）

表4 途徑三中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響（±s，n=3）Table 4 Effect of application of transglutaminase on protein yield in method 3（±s，n=3）

添加量（g/100mL） Y1（%） Y2（%）空白 57.68±0.82 38.44±0.38 0.5 45.35±0.92 58.09±0.46 0.3 43.77±0.80 55.48±0.52 0.1 41.70±0.84 54.27±0.36

由表4可知，隨著TGase添加量的增加，和空白相比，Y2有不同程度的增加，Y1有不同程度的減少，說(shuō)明途徑三的方法降低了蛋白質(zhì)得率。Y2的增加是因?yàn)門Gase的主成分也是蛋白質(zhì)，液相D中溶有來(lái)自TGase的蛋白質(zhì)。

綜合表2、表3和表4可知，在酸沉的過(guò)程中，根據(jù)途徑一的方法添加TGase，能夠使得蛋白質(zhì)的得率約提高5%；TGase產(chǎn)品說(shuō)明中的pH6.0不適宜用來(lái)提高南極磷蝦蛋白質(zhì)得率。

3 結(jié)論

堿溶酸沉法能夠較好地回收南極磷蝦蛋白質(zhì)；在酸沉的過(guò)程中，合理添加TGase能夠提高蛋白質(zhì)得率約5%，原因在于酸沉的過(guò)程中添加TGase可以使得原來(lái)不能被沉淀回收的部分小分子蛋白質(zhì)和肽由于受TGase作用，分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，分子量變大，功能性質(zhì)改變。酸沉過(guò)程中，添加TGase后的最適酸沉條件需要進(jìn)一步研究。堿溶酸沉法回收的南極磷蝦蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、功能性質(zhì)和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)值得進(jìn)一步研究。

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Effect of transglutaminase on yield of proteins extracted from whole Antarctic krill（Euphausia superba）by alkaline solubilization and acid precipitation method

WANG Ling-zhao1，2，XUE Chang-hu1，*，WANG Yu-ming1，XUE Yong1
（1.College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.School of Marine Science and Technology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China）

Alkaline solubilization and acid precipitation method was employed to extract proteins from whole Antarctic krill（Euphausia superba），and effect of transglutaminase on protein recovery yield was researched. Results indicated that the alkaline solubilization and acid precipitation method was good at recovering protein from whole Antarctic krill，and protein recovery yield was increased by approximate 5%，when transglutaminase was correctly applied during acid-induced protein precipitation.

Antarctic krill；protein yield；alkaline solubilization and acid precipitation method；transglutaminase

TS254.1

A

1002－0306（2012）03－0139－03

2011－02－14 *通訊聯(lián)系人

王靈昭（1976－），男，博士研究生，講師，研究方向：食品資源開(kāi)發(fā)與利用。

國(guó)際科技合作項(xiàng)目（2010DFA31330）；國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2011AA090801）。