凡納濱對(duì)蝦肌肉蛋白質(zhì)組成及分子量分布研究

藍(lán)尉冰，毛偉杰，池岸英，吉宏武，*

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524025；2.廣東省高等學(xué)校水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524025）

凡納濱對(duì)蝦肌肉蛋白質(zhì)組成及分子量分布研究

藍(lán)尉冰1，2，毛偉杰1，池岸英1，2，吉宏武1，2，*

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524025；2.廣東省高等學(xué)校水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524025）

為了合理利用凡納濱對(duì)蝦蛋白質(zhì)，對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉進(jìn)行蛋白分離，利用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)蛋白的氨基酸組成及用SDS-聚丙烯酰胺電泳測(cè)定分子量分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：總蛋白為（19.72±0.08）g/100g濕重，其中鹽溶蛋白64.30%、水溶性蛋白25.00%、基質(zhì)蛋白5.78%、非蛋白氮4.92%；凡納濱對(duì)蝦各蛋白氨基酸比例存在一定差異，但它們的第一限制氨基酸類似；SDS-PAGE電泳顯示，凡納濱對(duì)蝦基質(zhì)蛋白分子量分布范圍較寬，集中在200～19ku，鹽溶蛋白分子量集中在200～45ku，水溶性蛋白分子量集中在80～27ku。

凡納濱對(duì)蝦，蛋白質(zhì)分離，氨基酸，分子量分布

凡納濱對(duì)蝦又稱南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei Boone）[1]，屬對(duì)蝦科（Family Penaeidae）、對(duì)蝦屬（Genus Penaeus）、白對(duì)蝦亞屬（Subgenus Litopenaeus），原產(chǎn)于南美太平洋沿岸的水域，以厄瓜多爾沿岸分布最為集中，是當(dāng)今世界養(yǎng)殖蝦類產(chǎn)量最高的三大品種之一[1]。該蝦肉質(zhì)鮮美，蛋白含量高，加工出肉率高，是目前我國(guó)養(yǎng)殖量最大的對(duì)蝦之一[2]。凡納濱對(duì)蝦捕獲量大，但在氣溫高時(shí)，鮮蝦不宜保存，易腐敗，除少數(shù)鮮售外，大多制成經(jīng)濟(jì)價(jià)值不高的蝦皮、蝦醬等，有相當(dāng)一部分因未能得到及時(shí)有效的利用而腐敗變質(zhì)，造成很大的資源浪費(fèi)。因此，了解凡納濱對(duì)蝦蛋白質(zhì)的構(gòu)成及其食品化學(xué)特性，對(duì)于如何合理利用凡納濱對(duì)蝦這一蛋白質(zhì)資源具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。近年來，有關(guān)南美白對(duì)蝦肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的研究工作已有不少[3]。潘英[4]等人進(jìn)行海水和淡水養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的分析比較研究；韓素珍[5]對(duì)中國(guó)對(duì)蝦、姚根娣[6]對(duì)羅氏沼蝦進(jìn)行肌肉總蛋白分析。但迄今為止，尚未見到對(duì)于蝦肌肉蛋白進(jìn)行系統(tǒng)分離的報(bào)道，這使得凡納濱對(duì)蝦合理加工及其高值化應(yīng)用受到一定限制。本文在Saito[7]的基礎(chǔ)上，對(duì)凡納濱對(duì)蝦蛋白進(jìn)行分離，并測(cè)定各蛋白組分含量、氨基酸組成并對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)、分子量分布等，旨在為凡納濱對(duì)蝦蛋白質(zhì)資源利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮凡納濱對(duì)蝦（Penaeus Vannamei） 于2010年11月20號(hào)購于湛江市東風(fēng)市場(chǎng)；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 TaKaRa寶生物工程有限公司；KCl、NaH2PO4、Na2HPO4、H3PO4、考馬斯亮藍(lán)R250等 均為分析純。

HR2864飛利浦三合一攪拌器 珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)飛利浦家庭電器有限公司；FA2004電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 湛江裕鑫實(shí)業(yè)有限公司；PB-10玻璃膜電極pH測(cè)量器 德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；HYP-2消化爐 上海纖檢儀器有限公司；日立835-50高速氨基酸分析儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；DYY-Ⅲ-4型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCZ-23A型電泳槽 北京六一儀器廠；UC-1200超聲波清洗機(jī) 廣州維力超聲電子設(shè)備有限公司；arium633/arium611超純水系統(tǒng) 德國(guó)Sartorious公司；HH.S21-6恒溫水浴鍋 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；Alpha1-4冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；3-550 PD.NEY馬弗爐 VULCAN；FR-1000生物圖像分析系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基本營(yíng)養(yǎng)成分分析 水分含量的測(cè)定：105℃干燥至恒重法[8]；粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：凱氏定氮法[9]；粗脂肪含量的測(cè)定：索氏抽提法[10]；灰分含量的測(cè)定：550℃灰化爐法[10]。

1.2.2 肌肉蛋白質(zhì)分離方法 參照Saito[7]等的方法稍作修改。取蝦肉分散于2倍體積的磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L，pH7.4）中，高速組織勻漿機(jī)勻漿2min，勻漿液置于4℃條件下，抽提90min（不時(shí)攪拌），離心（10000r/min，20min，4℃），收集上清液，將沉淀分散于磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L，pH7.4）中，重復(fù)上述操作，收集兩次離心后的上清液進(jìn)行水溶性蛋白的測(cè)定。在上清液中加入10%的TCA（比例1∶1），離心得上清液，用于非氮白氮（NPN）的測(cè)定。取上述除去水溶性蛋白后的殘留物，分散于4倍體積的磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.4含1.1mol/L的NaCl）中，高速組織勻漿機(jī)勻漿2min，置于4℃條件下抽提18h（不時(shí)攪拌），再對(duì)其離心（10000r/min，20min，4℃），所得上清液即為鹽溶性蛋白質(zhì)；所得的沉淀用蒸餾水、1.1mol/L NaCl洗滌3次，即得基質(zhì)蛋白。

1.2.3 蛋白質(zhì)和非蛋白氮測(cè)定[9]采用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)和非蛋白氮含量。

1.2.4 蛋白質(zhì)組分的氨基酸分析[11]樣品經(jīng)6mol/L HCl水解后，采用日立835-50型高速氨基酸分析儀進(jìn)行15種蛋白質(zhì)組成氨基酸的分析。另取樣品用5mol/L NaOH水解后，采用同機(jī)測(cè)定色氨酸含量。儀器參數(shù)如下：離子交換柱規(guī)格：2.6×150mm；交換樹脂型號(hào)：No 2619（52051）；柱溫：53℃；泵流速：0.225mL/min；泵壓力：8.8MPa；洗脫液：IPH-1、2、3、4；進(jìn)樣體積：50μL。氨基酸的含量（mg/g粗蛋白）表示為蛋白中每克粗蛋白所含氨基酸的毫克數(shù)。

1.2.5 蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià) 根據(jù)1973年FAO/ WHO建議的每克氮氨基酸評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)[12]，計(jì)算其氨基酸評(píng)分（AAS），公式如下。

1.2.6 蛋白質(zhì)組分分子量的測(cè)定[13]采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)組分分子量的測(cè)定，濃縮膠濃度5%，分離膠濃度10%，采用R-250考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色檢測(cè)，醋酸甲醇溶液進(jìn)行脫色。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和作圖均采用Excel。

2 結(jié)果與討論

2.1 凡納濱對(duì)蝦基本營(yíng)養(yǎng)組成

凡納濱對(duì)蝦基本營(yíng)養(yǎng)組成及與其他蝦類的基本營(yíng)養(yǎng)組成比較見表1。

由表1可見，凡納濱對(duì)蝦肌肉中水分為77.7%，與日本對(duì)蝦[16]相近。蛋白質(zhì)含量19.72%，略低于中國(guó)對(duì)蝦20.62%[14]，但高于中國(guó)毛蝦和日本對(duì)蝦。脂肪含量均低于中國(guó)對(duì)蝦、中國(guó)毛蝦、日本對(duì)蝦。因此，凡納濱對(duì)蝦肉是一種高蛋白低脂肪的優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)原料。

2.2 凡納濱對(duì)蝦含氮化合物組成

表1 凡納濱對(duì)蝦與其他蝦類基本營(yíng)養(yǎng)組成比較（%，n=5）Table 1 Comparison of the primary nutrition components in Penaeus Vannamei and other shrimp（%，n=5）

表2 凡納濱對(duì)蝦各含氮化合物含量（n=5）Table 2 Content of nitrogen compounds in Penaeus Vannamei（n=5）

凡納濱對(duì)蝦含氮化合物組成分析結(jié)果見表2。

對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉進(jìn)行粗分離，得到水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、基質(zhì)蛋白和非蛋白氮四個(gè)組分，各組分含量見表2。由表2可見，凡納濱對(duì)蝦肌肉粗蛋白含氮量為（19.72±0.08）g/100g濕重，與潘英[4]等人進(jìn)行海水和淡水養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的分析比較研究，得出南美白對(duì)蝦肌肉的蛋白質(zhì)含量為19.1%～23.3%相符合。其中鹽溶性蛋白含氮量最高，為（12.68±0.04）g/100g濕重；非蛋白氮含氮量最低，為（0.97±0.02）g/100g濕重。各蛋白組分含氮量依次為：鹽溶性蛋白＞水溶性蛋白＞基質(zhì)蛋白。

2.3 凡納濱對(duì)蝦肌肉各含氮化合物占總氮的百分比

凡納濱對(duì)蝦肌肉各含氮化合物占總氮百分比分析結(jié)果見表3。

表3 凡納濱對(duì)蝦肌肉中各含氮化合物所占總氮的百分比（%）Table 3 The percentage of nitrogen compounds in Penaeus Vannamei muscle（%）

對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉進(jìn)行粗分離，得到水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、基質(zhì)蛋白三個(gè)蛋白組分，各蛋白組分含氮量占凡納濱對(duì)蝦蝦肉總氮的比例見表3。由表3可知，凡納濱對(duì)蝦肉中鹽溶性蛋白所占比例最高，為64.30%，基質(zhì)蛋白所占比例最低，為5.78%。此結(jié)果與丁玉庭[17]等人研究分離得到的魚蛋白組分含量：肌原纖維蛋白質(zhì)占總氮的60.7%～64.4%，肌漿蛋白質(zhì)為26.1%～33.2%，總基質(zhì)蛋白質(zhì)為9.0%～20.8%相符合，發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦的鹽溶性蛋白含量與魚鹽溶性蛋白含量相近，而基質(zhì)蛋白含量遠(yuǎn)低于魚基質(zhì)蛋白含量，這主要是由于魚含有魚皮及結(jié)締組織高于蝦的緣故。

2.4 凡納濱對(duì)蝦蝦肉蛋白組分的氨基酸組成及特性分析

凡納濱對(duì)蝦肌肉蛋白及各組分蛋白氨基酸組成見表4，由表4可知，凡納濱對(duì)蝦蝦肉中含有16種氨基酸，其總含量為86.28g/100g，且含有人體所必需的8種必需氨基酸（Thr、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Trp和Lys），占總氨基酸高達(dá)41.31%；各蛋白氨基酸總量依次為：蝦肉＞水溶性蛋白＞鹽溶性蛋白＞基質(zhì)蛋白，分別為：86.28、68.06、50.73、24.25g/100g。蛋白鹽溶蛋白和基質(zhì)蛋白必需氨基酸分別為40.82%和41.81%，根據(jù)FAO/WHO推薦的理想氨基酸模式，質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)氨基酸組成中必需氨基酸為氨基酸總量40%左右。因此鹽溶蛋白、基質(zhì)蛋白和蝦肉蛋白的氨基酸成分齊全，比例合理，蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白。

蝦肉味道鮮美的程度由肌肉中鮮味氨基酸的組成和含量來決定。甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸和天門冬氨酸是鮮味氨基酸，其中谷氨酸、天門冬氨酸這兩種氨基酸為呈鮮味的特征性氨基酸，而甘氨酸、丙氨酸是呈甘味的特征性氨基酸[18]。由表4可知，凡納濱蝦肉及各組分蛋白氨基酸含量中，基質(zhì)蛋白呈味氨基酸最高，達(dá)到52.95%，鹽溶性蛋白呈味氨基酸較低，為47.80%。而在呈味氨基酸中，谷氨酸居首位，分別為：蝦肉（13.48）、水溶性蛋白（8.58）、鹽溶性蛋白（8.73）、基質(zhì)蛋白（3.66），分別占總氨基酸含量15.62%、12.61%、17.21%、15.09%。這與潘英[4]等人報(bào)道的南美白對(duì)蝦肌肉谷氨酸含量最高，占氨基酸總量的15.6%一致。谷氨酸在人體代謝中具有重要意義，為腦組織生化代謝中的首要氨基酸，參與多種生理活性物質(zhì)的合成，在大腦肌肉肝臟等組織中發(fā)揮解毒的作用。肌肉中除谷氨酸外，天門冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸的含量也較高。故凡納濱對(duì)蝦水溶性蛋白、鹽溶蛋白、基質(zhì)蛋白和蝦肉蛋白是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、味道鮮美、食用價(jià)值高的海產(chǎn)品。

表4 凡納濱對(duì)蝦蝦肉蛋白組分的氨基酸組成（g/100g，以干基計(jì)）Table 4 Amino acids composition of proteins in Penaeus Vannamei muscle（g/100g，dry basis）

此外，支鏈氨基酸具有獨(dú)特的生理功能，能消除或減輕肝性腦病癥狀，改善肝功能和病人蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)失常狀態(tài)及抗疲勞等功能[19]。在凡納濱對(duì)蝦肌肉各蛋白組分中支鏈氨基酸的含量都較高，基質(zhì)蛋白支鏈氨基酸含量最高，達(dá)16.99%，而水溶性蛋白支鏈氨基酸含量較低，為15.25%。

2.5 凡納濱對(duì)蝦蝦肉蛋白組分必需氨基酸評(píng)分

表5 凡納濱對(duì)蝦蝦肉蛋白組分必需氨基酸評(píng)分Table 5 AAS of proteins in Penaeus Vannamei muscle

凡納濱對(duì)蝦肌肉及其分離蛋白的AAS見表5，根據(jù)FAO/WHO 1973年建議的每克氮氨基酸評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式，由表5可見，各蛋白的氨基酸比例存在一定的差異，水溶性蛋白、鹽溶蛋白第一限制氨基酸都為色氨酸，僅為48、35。但水溶性蛋白酪氨酸+苯丙氨酸的AAS較高，達(dá)到了91?；|(zhì)蛋白第一限制氨基酸為纈氨酸和色氨酸，僅為21。蝦肉蛋白第一限制氨基酸為蘇氨酸，為79，而其賴氨酸含量最高，為127。賴氨酸可以促進(jìn)食欲，具有促進(jìn)幼兒生長(zhǎng)和發(fā)育的作用，還能提高鈣的吸收及其在體內(nèi)積累，加速骨骼生長(zhǎng)，所以蝦肉高賴氨酸含量對(duì)于以谷物為主的膳食者，可以彌補(bǔ)其賴氨酸的不足，從而提高人體對(duì)蛋白質(zhì)的利用率。

2.6 凡納濱對(duì)蝦各蛋白質(zhì)組分分子量分布

圖1 蛋白質(zhì)組分SDS-PAGE電泳Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of the muscle proteins

從圖1結(jié)果可看出，三種蛋白質(zhì)組分的分子量分布存在明顯的差異性，基質(zhì)蛋白分子量分布范圍較寬，在200～19ku之間，并且在200、44、27ku均出現(xiàn)了比較明顯的蛋白條帶。凡納濱對(duì)蝦肌肉鹽溶性蛋白主要是肌原纖維蛋白，由肌球蛋白重鏈（MHC）、輕鏈、肌動(dòng)蛋白和a-輔肌動(dòng)蛋白等構(gòu)成，在圖中200ku處為肌球蛋白重鏈，而在45ku附近處則為肌動(dòng)蛋白，凡納濱對(duì)蝦肌肉鹽溶性蛋白分子量集中在200～45ku之間；水溶性蛋白在SDS-PAGE電泳中的條帶不是十分清晰，而且部分成連續(xù)帶狀，出現(xiàn)了明顯的帶狀染色，這可能是由于水溶性蛋白中含有的相近分子量蛋白比較多，分子量非常接近而使得在電泳中無法分開，出現(xiàn)模糊的蛋白條帶只是在此分子量范圍相對(duì)含量比較集中。因此，凡納濱對(duì)蝦水溶性蛋白集中分布在低分子量范圍80～27ku之間。此測(cè)定結(jié)果與鄭惠娜[20]等對(duì)馬氏珠母貝蛋白分子量分布研究結(jié)果類似。

3 結(jié)論

凡納濱對(duì)蝦蝦肉粗蛋白含量19.72%，脂肪含量0.82%，是典型的高蛋白低脂肪型食物。蝦肌肉中各組分含氮量依次為：鹽溶性蛋白＞水溶性蛋白＞基質(zhì)蛋白＞非蛋白氮，各占肌肉總蛋白64.30%、25.00%、5.78%、4.92%。水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、基質(zhì)蛋白和蝦肉蛋白氨基酸種類齊全，組成理想，各蛋白氨基酸總量依次為：蝦肉＞水溶性蛋白＞鹽溶性蛋白＞基質(zhì)蛋白，分別為：86.28、68.06、50.73、24.25g/100g，其中鹽溶性蛋白和基質(zhì)蛋白必需氨基酸達(dá)40.82%和41.81%，各蛋白的氨基酸比例存在一定的差異，但它們第一限制氨基酸類似。凡納濱對(duì)蝦基質(zhì)蛋白分子量分布范圍較寬，為200～19ku，水溶性蛋白分子量范圍80～27ku，鹽溶性蛋白分子量為200～45ku，肌球蛋白重鏈在200ku處，而在45ku附近處則為肌動(dòng)蛋白。以上研究將為凡納濱對(duì)蝦高值化加工利用提供理論基礎(chǔ)。

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Study on muscle protein composition and molecular weight distribution of Penaeus Vannamei

LAN Wei-bing1，2，MAO Wei-jie1，CHI An-ying1，2，JI Hong-wu1，2，*
（1.College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China；2.KeyLaboratoryofAquaticProductAdvancedProcessingofGuangdongHigherEducationInstitutions，Zhanjiang524025，China）

For the rational use of protein in Penaeus Vannamei，the muscle protein was separated.Amino acid composition was detected by amino acid analyzer and molecular weight was determined by SDS-PAGE electrophoresis.The results showed that the total protein content was（19.72±0.08）g/100g wet weight，and the proportion of salt-soluble protein，water-soluble protein，matrix protein，non-protein nitrogen was 64.30%，25.00%，5.78%，4.92%，respectively.There existed some differences in the proportion of each protein amino acid，but the first limiting amino acid was similar.The result of SDS-PAGE electrophoresis displayed that the molecular weight of salt-soluble protein，water-soluble protein，matrix protein were 200～45ku，80～27ku，200～19ku，respectively.

Penaeus Vannamei；protein separation；amino acid；molecular weight distribution

TS254.1

A

1002-0306（2012）09-0049-04

2011－08－02 *通訊聯(lián)系人

藍(lán)尉冰（1987-），女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品深加工。

國(guó)家蝦產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)（CARS-48）；科技部農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（2010GB2E000345）；廣東省海洋漁業(yè)科技攻關(guān)重大項(xiàng)目（A201008102）；廣東省科技團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2011A020102005）。