高效液相色譜法測定五柏參洗液中苦參堿的含量

劉 瓊

（湖南安化縣人民醫(yī)院藥劑科，湖南 安化 413500）

五柏參洗液由黃柏、苦參、百部、五味子4味中藥組成，具有清熱、除濕、止癢等功效。用于濕熱下注型陰道炎所致帶下量多，色黃，味臭?？鄥楸局苿┑木?，其主要有效成分為苦參堿，苦參堿對大腸桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌及乙型鏈球菌均有明顯的抑制作用， 水煎劑在體外對某些常見的皮膚真菌有不同程度的抑制作用[1]。本文重點研究苦參堿的含量測定方法，為控制該制劑的產(chǎn)品質(zhì)量和提高其藥品標(biāo)準(zhǔn)水平提供依據(jù)。

1 材 料

Agilent 1200型HPLC測定儀，包括G1314B紫外檢測器、Agilent色譜工作站（美國Agilent科技有限公司）；苦參堿對照品（供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所，批號110805－200507）；五柏參洗液（批號111021，120215，120510，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字B20020613）；陰性樣品液為自制；乙腈、甲醇為色譜純（Fisher）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱： Agilent XDB-C18（150 mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-磷酸鹽緩沖液（pH 6.8，v/v= 20∶75）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：220 nm；進樣量：10μL。理論塔板數(shù)按苦參堿計算不得低于5×103。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的苦參堿對照品適量，加甲醇溶解并稀釋成苦參堿對照品貯備液（270mg/L），再精密量取該貯備液1mL，置于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液

取本品50 mL，搖勻，精密量取5 mL，加濃氨試液調(diào)pH＝10～12后，用氯仿（30、30、30、20、20 mL）提取5次，合并提取液，揮干氯仿，加甲醇適量溶解殘渣，濾過，濾渣、容器用甲醇洗滌3次，每次5 mL，合并洗液與濾液，定量轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照樣品溶液

按處方比例配制不含苦參的陰性樣品，按”2.2.2”項下方法，制備陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10μL，注入HPLC儀測定，色譜圖見圖1。結(jié)果，供試品色譜中苦參堿與雜質(zhì)峰分離良好，陰性對照色譜在苦參堿相應(yīng)位置處無干擾峰，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖（A.供試品；B.陰性對照品；C.對照品；1-苦參堿）

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取對照品1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別置于10mL容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻。分別取10μL，注入HPLC儀測定。以質(zhì)量濃度（Y）為縱坐標(biāo)，以峰面積（A）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程為Y= 2.36×10-4A – 1.94（r= 0.9995）。結(jié)果表明，苦參堿檢測濃度在27.00～135.00 mg/L濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

精密量取同一對照品溶液適量，重復(fù)進樣6次，按照“2.1”項下色譜備件測定。結(jié)果，RSD為0.33%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密量取同一對照品溶液適量，按樣品含量測定項下操作，隔3h測一次，共測定5次，計算含量。結(jié)果，RSD＝0.19%，說明供試品在16h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取含量測定項下的供試品溶液（批號：201205102）適量，重復(fù)測定6次。結(jié)果，RSD＝0.39%，說明重復(fù)性良好。

2.8 回收試驗

采取加樣回收法。精密吸取已知含量的樣品（批號201205102，0.84 g/L）2.5mL，至蒸發(fā)皿中，精密加入苦參堿對照品貯備液7，8，9 mL（即加入1.89，2.16，2.43 mg），照“2.2.2 ”項下方法制備供試液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.9 樣品含量測定

取3批五柏參洗液（批號201110212，201202151，201205102）按”2.2.2” 項下方法提取及“2.1”項的色譜條件測定，以峰面積代入回歸方程中計算苦參堿含量。結(jié)果見表2。

表2 五柏參洗液中苦參堿含量測定結(jié)果

3 討 論

3.1 檢測方法的確定

苦參堿的含量測定有容量法、薄層掃描法、高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法等，筆者參考苦參堿含量測定的相關(guān)報道[2-5]，采用HPLC 法測定本制劑中苦參堿的含量。

3.2 檢測波長的選擇

經(jīng)對比不同檢測波長下色譜峰的強度和分離度，確認(rèn)苦參堿在220nm檢測波長下有最大吸收，且干擾峰少，據(jù)此本實驗中選擇220nm作為測定苦參堿的檢測波長。

3.3 流動相的選擇

本實驗在流動相選擇上曾使用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（1∶9）、乙腈-0.005 mol/L庚烷基磺酸鈉溶液（25∶75）、乙腈-磷酸鹽緩沖液（pH 6.8，v/v= 20∶75）。經(jīng)多次測試結(jié)果表明，采用乙腈-磷酸鹽緩沖液（pH 6.8，v/v= 20∶75），可以有效改善苦參堿峰形，抑制峰拖尾，理論塔板數(shù)均符合相關(guān)要求。因此，選擇乙腈-磷酸鹽緩沖液為流動相。

3.4 萃取次數(shù)和PH的考察

取五柏參洗液5 mL，加濃氨試液調(diào)pH＝10后，分別用氯仿（30、30、30、20、20、20 mL）提取3、4、5、6次，合并提取液，揮干氯仿，加甲醇適量溶解殘渣，濾過，濾渣，容器用甲醇洗滌3次，每次5 mL，合并洗液與濾液，定量轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，通過比較峰面積，5次萃取基本可將苦參堿萃取完全。萃取苦參堿時，調(diào)節(jié)溶液pH＜9，則測定結(jié)果偏差較大，這可能與苦參堿的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)[6]，因此操作上應(yīng)加以注意。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于五柏參洗液的質(zhì)量控制。

[1]高學(xué)敏.中藥學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2007:103.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:141-582.

[3]夏學(xué)勵.HPLC法測定癬凈顆粒中苦參堿、氧化苦參堿的含量[J].中國藥房,2009,20(18):1420.

[4]葉秀金,宋粉云.HPLC法測定清肺抑火丸中苦參堿和氧化苦參堿的含量[J].中國藥房,2011,22(12):1127.

[5]佘志華,文曉柯,吳雅麗.高效液相色譜法測定陰炎凈中苦參堿的含量[J].中南藥學(xué),2008,6(5):559.

[6]崔鸚,張懿,胡春梅.苦參生物堿的提取與分離[J].重慶工學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2007,21(3):113-116.