作物種子超低溫保存方法的構(gòu)建

趙躍平，燕平梅，邢 勇，張小冰，王小麗

（太原師范學(xué)院生物系，山西 太原 030031）

種質(zhì)資源是人類極其珍貴的財(cái)富。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，地球不斷開(kāi)發(fā)及生態(tài)環(huán)境破壞，每年都有多個(gè)物種消失或?yàn)l臨滅絕。各種植物，包括栽培種、野生種甚至雜草，都具有各自獨(dú)特的優(yōu)良基因，是植物品種改良乃至農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)。它們是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化而來(lái)，一旦失去不會(huì)再生。因此，世界各國(guó)都很重視植物種質(zhì)資源的收集與保存的研究。

全世界擁有的作物種質(zhì)資源96%以上是以種子形式保存的。溫度是影響種子新陳代謝的主要因素之一，在低溫狀態(tài)下，種子細(xì)胞內(nèi)代謝活動(dòng)水平很低，物質(zhì)和能量消耗少，細(xì)胞的衰老進(jìn)程也很緩慢，因而可以長(zhǎng)期保持種子生活力。國(guó)內(nèi)外研究證明,利用液氮（-196℃）超低溫冷凍技術(shù)可安全保存許多植物的種子、花粉、分生組織、芽、愈傷組織和細(xì)胞等[1]。超低溫冷凍保存一般以液態(tài)氮為冷源,使保存溫度維持在-196℃。生物材料在如此低溫下,新陳代謝活動(dòng)基本停止,處于“生機(jī)停頓”（Suspanded animation）狀態(tài)[2]。 這就有可能極大地延長(zhǎng)儲(chǔ)藏種子的壽命，而不產(chǎn)生遺傳變異,從而有效地、安全地長(zhǎng)期保存那些珍貴稀有的種質(zhì)[2]。利用液態(tài)氮保存植物種質(zhì),冷凍容器就是液氮罐，除了30～60天補(bǔ)充一次液氮外,不需要機(jī)械空調(diào)設(shè)備及其它管理,節(jié)省了大量的人力和物力，并且可以保持被保存組織及細(xì)胞培養(yǎng)物的遺傳穩(wěn)定性，是一種省時(shí)、省工、省費(fèi)用的種質(zhì)超低溫保存新技術(shù)[3～5]。當(dāng)解凍后，能夠恢復(fù)再生能力。

種子的發(fā)芽率和活力指數(shù)是種子活力的重要指標(biāo)之一[5，6]。冷凍方式和解凍方式是影響種子超低溫貯藏效果最重要的兩個(gè)因素。為此,本試驗(yàn)選用稀有作物豆類、麥類、粟類中的紅小豆、蕎麥、谷子為材料，測(cè)定經(jīng)過(guò)不同的冷凍和解凍方法處理后對(duì)種子發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)的影響,以構(gòu)建植物種質(zhì)資源超低溫保存的最適方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅小豆、蕎麥、谷子種子購(gòu)于山西省左云、興縣和朔州地方種子站。

1.2 方法

1.2.1 冷凍和解凍方法

在中國(guó)農(nóng)科院和山西農(nóng)科院鑒定種子。將種子分成三組，用聚乙烯袋包裝后冷凍：第一組種子直接投入液氮中保存；第二組種子經(jīng)-20℃（1天）→-70℃（2天）→-196℃溫度梯度冷凍；第三組經(jīng)-70℃（2天）→-196℃溫度梯度冷凍，三組保存在液氮中的種子，于保存30天后通過(guò)緩慢解凍（在18℃室溫緩慢解凍）和快速解凍（在38℃水浴鍋中解凍）兩種方法解凍。

1.2.2 超低溫保藏種子包裝材料

紅小豆、蕎麥、谷子三種種子用聚乙烯袋、鋁箔和牛皮紙袋包裝后直接投入液氮中保存30天快速解凍后發(fā)芽計(jì)算發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)。

1.2.3 超低溫保藏種子的含水量

1.2.3.1 種子水分調(diào)節(jié)：在裝有氧化鈣的干操器中干操或在飽和水蒸汽下吸濕，將種子調(diào)整為5種含水量范圍，分別為7% ～9%、12% ～14%、17% ～20%、30%～40%、40% ～50%。

1.2.3.2 含水量測(cè)定：整粒種子在105℃恒溫下干操24 h，以濕重為基數(shù)計(jì)算含水最。

1.2.4 種子的發(fā)芽和發(fā)芽指標(biāo)的測(cè)定

將解凍后的種子于25℃黑暗中經(jīng)蒸餾水浸泡24 h后用蒸餾水沖洗數(shù)次，選取40粒飽滿健狀的種子，置于鋪墊1層濾紙、2層紗布的培養(yǎng)皿中，置于25～30℃人工氣候培養(yǎng)箱中作萌發(fā)試驗(yàn)，各作三次重復(fù)，逐日記錄發(fā)芽數(shù)，并用蒸餾水沖洗補(bǔ)充水分。

測(cè)試種子的發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)，計(jì)算公式參照陶嘉齡介紹的方法[7]：發(fā)芽率 =（3天內(nèi)已發(fā)芽的種子數(shù)／全部種子數(shù)）×l00%；發(fā)芽指數(shù)（Gi）= ∑（Gt ／Dt）[式中：Gi為發(fā)芽指數(shù) ∑為總和，Gt為在t日的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)]；活力指數(shù)（VⅠ）=Gi×S[活力指數(shù)即生長(zhǎng)勢(shì)，S為一定時(shí)期（7天）內(nèi)幼苗長(zhǎng)度（cm），幼苗的長(zhǎng)度度用直尺測(cè)定]。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的整理采用Excel軟件完成，單因素差異顯著性測(cè)驗(yàn)采用鄧肯氏新復(fù)極差法完成，差異顯著水平用0.01＜P＜0.05表示，差異極顯著水平用P≤0.01表示。雙因素方差分析采用S-N-K方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同冷凍方式和解凍方式對(duì)種子發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)的影響

2.1.1 不同冷凍方式和解凍方式對(duì)紅小豆發(fā)芽率（%）的影響

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表1、表2）可知，預(yù)凍方式對(duì)紅小豆種子超低溫保存發(fā)芽率有顯著影響。3個(gè)處理中，未經(jīng)過(guò)預(yù)凍處理直接投入液氮保存的種子在快速解凍條件下，平均發(fā)芽率為100%，顯著高于分別經(jīng)過(guò)-70℃→-196℃溫度梯度和-20℃→ -70℃→-196℃溫度梯度冷凍兩種預(yù)凍處理的種子發(fā)芽率 （P＜0.05）；未經(jīng)過(guò)預(yù)凍處理直接投入液氮保存的種子在緩慢解凍條件下，平均發(fā)芽率為100%，顯著高于分別經(jīng)過(guò)-70℃→-196℃溫度梯度和-20℃→-70℃→-196℃溫度梯度兩種預(yù)凍處理的種子發(fā)芽率 （P＜0.05）。在-70℃→ -196℃溫度梯度與-20℃→ -70℃→ -196℃溫度梯度的預(yù)凍條件下，快速解凍時(shí)平均發(fā)芽率只達(dá)到94.59%和94.12%，保存效果差，但兩者之間未達(dá)到顯著差異；在-70℃→-196℃溫度梯度與-20℃→-70℃→-196℃溫度梯度的預(yù)凍條件下，緩慢解凍時(shí)平均發(fā)芽率只達(dá)到94.12%和92.50%，保存效果差，兩者之間也未達(dá)到顯著差異。經(jīng)過(guò)預(yù)凍處理的種子在保存后發(fā)芽率都有大幅度的下降。試驗(yàn)結(jié)果表明直接投入液氮方式較預(yù)凍方法 （溫度梯度）發(fā)芽率高。

表1 不同冷凍方式和解凍方式對(duì)紅小豆發(fā)芽率影響的多因素統(tǒng)計(jì)分析

表2 不同冷凍方式和解凍方式對(duì)紅小豆發(fā)芽率（%）的影響

由表1、表2可知，解凍方式對(duì)紅小豆種子的超低溫保存發(fā)芽率無(wú)顯著影響，直接投入液氮保存的種子在快速解凍和緩慢解凍的條件下發(fā)芽率均為100%；-70℃→-196℃溫度梯度冷凍種子，在快速解凍即38℃溫水浴條件下的平均發(fā)芽率與室溫18℃自然化凍方式，未達(dá)到顯著水平；-20℃→ -70℃→ -196℃溫度梯度冷凍的種子，在快速解凍即38℃溫水浴條件下的平均發(fā)芽率與室溫18℃自然化凍方式，兩者之間也未達(dá)到顯著水平。研究結(jié)果表明，解凍方式對(duì)發(fā)芽率無(wú)顯著影響。

由表1可知，冷凍方式和解凍方式交互作用：F=0.202、P=0.820＞0.05，接受無(wú)效假設(shè)，可以認(rèn)為因素 a和因素b之間交互效應(yīng)不顯著，即冷凍方式與解凍方式間不存在交互效應(yīng)。

2.1.2 不同冷凍方式和解凍方式對(duì)紅小豆生長(zhǎng)勢(shì)的影響

由表3、表4可以看出，預(yù)凍方式對(duì)紅小豆種子的超低溫保存生長(zhǎng)勢(shì)有顯著影響。三個(gè)處理中，未經(jīng)過(guò)預(yù)凍處理直接投入液氮保存的種子在快速解凍條件下平均生長(zhǎng)勢(shì)為700.23，顯著高于分別經(jīng)過(guò)-70℃→-196℃溫度梯度和-20℃→-70℃→-196℃溫度梯度冷凍兩種預(yù)凍處理的種子平均生長(zhǎng)勢(shì) （P＜0.05）；未經(jīng)過(guò)預(yù)凍處理直接投入液氮保存的種子在緩慢解凍條件下，平均生長(zhǎng)勢(shì)為618.39，顯著高于分別經(jīng)過(guò)-70℃→-196℃溫度梯度和-20℃→-70℃→-196℃溫度梯度冷凍兩種預(yù)凍處理的種子平均生長(zhǎng)勢(shì) （P＜0.05）。在-70℃→-196℃溫度梯度與-20℃— → -70℃→-196℃溫度梯度的預(yù)凍條件下，快速解凍時(shí)平均生長(zhǎng)勢(shì)分別為420.02、335.60，保存效果差，兩者之間達(dá)到顯著差異（P＜0.05）；在-70℃→ -196℃溫度梯度與-20℃→-70℃→-196℃溫度梯度的預(yù)凍條件下，緩慢解凍時(shí)平均生長(zhǎng)勢(shì)分別為343.26、279.02，保存效果差，兩者之間也達(dá)到顯著差異 （P＜0.05）。經(jīng)過(guò)預(yù)凍處理的種子在保存后生長(zhǎng)勢(shì)都大幅度下降，且-20℃→-70℃→-196℃溫度梯度的預(yù)凍種子生長(zhǎng)勢(shì)最低。試驗(yàn)結(jié)果表明，直接投入液氮方式較預(yù)凍方法（溫度梯度）生長(zhǎng)勢(shì)高。

表3 不同冷凍方式和解凍方式對(duì)紅小豆生長(zhǎng)勢(shì)影響的統(tǒng)計(jì)分析

表4 不同冷凍方式和解凍方式對(duì)紅小豆生長(zhǎng)勢(shì)的影響

由表3、表4統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可知，解凍方式對(duì)紅小豆種子的超低溫保存生長(zhǎng)勢(shì)有顯著影響。未經(jīng)過(guò)預(yù)凍處理直接投入液氮保存的種子，在38℃溫水浴條件下快速解凍的平均生長(zhǎng)勢(shì)高于室溫18℃自然化凍方式，兩者之間達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。-70℃ → -196℃溫度梯度冷凍種子，在38℃溫水浴條件下快速解凍的平均生長(zhǎng)勢(shì)高于室溫18℃自然化凍方式，兩者之間達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。-20℃ → -70℃ → -196℃溫度梯度冷凍的種子，在38℃溫水浴條件下快速解凍的平均生長(zhǎng)勢(shì)高于室溫18℃自然化凍方式，兩者之間達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，快速解凍方式較自然化凍方法生長(zhǎng)勢(shì)高。

由表3可知，冷凍方式和解凍方式交互作用：F=0.167、P=0.848＞0.05，接受無(wú)效假設(shè)，可以認(rèn)為因素 a和因素b之間交互效應(yīng)不顯著，即冷凍方式與解凍方式間不存在交互效應(yīng)。

綜上所述，超低溫保存紅小豆種子應(yīng)選擇未經(jīng)過(guò)預(yù)凍處理直接投入液氮保存方法：解凍應(yīng)采用快速解凍方法。

不同冷凍方式和解凍方式對(duì)蕎麥和谷子種子發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)的影響規(guī)律與對(duì)紅小豆種子的影響規(guī)律類似，故相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)從略。

2.2 不同包裝材料對(duì)超低溫保存種子發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)的影響

三種包裝材料對(duì)超低溫保存紅小豆種子發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)的影響見(jiàn)表5，聚乙烯塑料袋和鋁箔包裝種子在液氮保存30天的發(fā)芽率顯著高于用牛皮紙包裝的；而聚乙烯塑料袋包裝與鋁箔包裝種子的發(fā)芽率無(wú)顯著差異。三種包裝材料包裝種子在液氮保存30天的發(fā)芽勢(shì)無(wú)顯著差異。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，液氮保存種子使用聚乙烯塑料袋和鋁箔包裝材料好于牛皮紙包裝。

蕎麥和谷子種子在使用包裝材料上和紅小豆結(jié)果一樣，即聚乙烯塑料袋和鋁箔包裝材料好于牛皮紙包裝。

2.3 超低溫保存種子含水量對(duì)發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)的影響

表5 不同包裝材料對(duì)超低溫保存紅小豆種子發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)的影響

2.3.1 不同含水量對(duì)超低溫保存紅小豆種子發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)的影響

由表6可知，含水量為7.89%、12.48%、18.77%、36.91%和40.12%的紅小豆種子在液氮中保存30天后，發(fā)芽率差異顯著（P＜0.05），發(fā)芽率從高到低的順序?yàn)?2.48%＞7.89%＞18.77%＞36.91%＞40.12%。12.48%含水量紅小豆種子在液氮中保存30天后生長(zhǎng)勢(shì)顯著高于其它四種含水量的種子；36.91%和40.12%含水量種子的生長(zhǎng)勢(shì)最低，兩者無(wú)顯著差異；7.89%和18.77%含水量種子的生長(zhǎng)勢(shì)次之，兩者無(wú)顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果明，12.48%含水量（自然風(fēng)干）的紅小豆在液氮中保藏效果最好。

2.3.2 不同含水量對(duì)超低溫保存蕎麥種子發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)的影響

由表7可知，含水量為7.21%、12.63%、17.59%、36.37%和40.29%的蕎麥種子在液氮中保存30天后，發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)差異顯著 （P＜0.05），12.63%含水量種子的發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)顯著高于其它四種含水量 （P＜0.05）；7.21%含水量種子的發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)顯著高于17.59%、36.37%和 40.29%的含水量 （P＜0.05）；17.59%含水量種子的發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)顯著高于36.37%的含水量（P＜0.05）；與40.29%含水量種子的發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)無(wú)顯著差異。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，12.63%含水量（自然風(fēng)干）的蕎麥種子在液氮中保藏效果最好。

表7 不同含水量對(duì)超低溫保存蕎麥種子發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)的影響

2.3.3 不同含水量對(duì)超低溫保存谷子種子發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)的影響

由表8可知，含水量為7.39%、13.15%、18.16%、36.68%和40.59%的谷子種子在液氮中保存30天后發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)差異類同，13.15%含水量種子的發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)顯著高于其它四種含水量 （P＜0.05），18.16%含水量種子的發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)顯著高于7.39%、36.68%和40.59%的含水量（P＜0.05）；后三者含水量種子的發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)無(wú)顯著差異。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，13.15%含水量（自然風(fēng)干）的谷子種子在液氮中保藏效果最好。

表8 不同含水量對(duì)超低溫保存谷子種子發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)的影響

從三種農(nóng)作物（紅小豆、蕎麥和谷子）種子的7%～9%、12% ～14%、17% ～20%、30% ～40%、40% ～50%五個(gè)含水量的發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果可知，12%～14%含水量（自然風(fēng)干）范圍適合液氮保存。

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)預(yù)冷和直接在液氮中的冷凍方法和解凍方法對(duì)種子生活力的影響進(jìn)行了初步研究，觀察到經(jīng)過(guò)快速冷凍和快速解凍處理的種子效果最好。

細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性是種子活力的基礎(chǔ)[8]。將植物種子直接投入液氮中保存，降溫速度極快，種子內(nèi)的水分在降溫冷凍過(guò)程中，從-10℃～-140℃范圍內(nèi)是冰晶形成和增長(zhǎng)的危險(xiǎn)溫度區(qū)，到-140℃時(shí)完全停止增長(zhǎng)，利用高速降溫越過(guò)冰晶增長(zhǎng)的危險(xiǎn)溫度區(qū)，不能形成致死的冰晶，細(xì)胞內(nèi)水分固化，不會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)?？焖倮鋬鍪且环N以快速通過(guò)冰晶生長(zhǎng)危險(xiǎn)溫度區(qū)使種子進(jìn)入玻璃化[4]，從而減小細(xì)胞傷害的有效途徑。而預(yù)冷的種子降溫速度慢，不能越過(guò)危險(xiǎn)溫度區(qū)，冰晶形成并增長(zhǎng)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。因此，快速冷凍效果最佳。

超低溫保存中，冰凍傷害有時(shí)在冰凍過(guò)程中不發(fā)生，但在解凍過(guò)程中發(fā)生[9]。-5～-10℃是再結(jié)冰的溫度區(qū)，緩慢解凍時(shí)，細(xì)胞內(nèi)易發(fā)生劇烈再結(jié)晶和冰晶體增大，使細(xì)胞死亡；快速解凍能使其通過(guò)危險(xiǎn)溫度區(qū)而防止解凍過(guò)程中再結(jié)晶，冰晶體增大，對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷，細(xì)胞膜不漲裂，種子仍有較高活力；緩慢解凍的種子破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜受到損傷，修復(fù)能力減弱，種子活力降低。解凍速度是解凍技術(shù)的關(guān)鍵。解凍速度慢，細(xì)胞內(nèi)容易發(fā)生再結(jié)晶而導(dǎo)致細(xì)胞死亡；解凍速度快來(lái)不及再結(jié)晶，細(xì)胞存活，所以快速解凍優(yōu)于緩慢解凍。

植物種子液氮保存時(shí)都有一個(gè)適宜的含水量范圍。液氮保存并非含水量越低越好，含水量降到一定極限則產(chǎn)生脫水損傷，導(dǎo)致種子發(fā)芽能力傷失[9]。本試驗(yàn)探究不同含水量對(duì)液氮保存種子發(fā)芽率的影響，結(jié)果顯示，低含水量（7%～9%）的種子保存在液氮中的發(fā)芽率低于自然風(fēng)干種子（12%～14%）的發(fā)芽率。

由本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可知，快速冷凍和快速解凍處理的種子效果最好，低含水量（7%～9%）的種子保存在液氮中的發(fā)芽率低于自然風(fēng)干種子 （12%～14%）的發(fā)芽率；采用不同包裝材料包裝紅小豆、蕎麥和谷子種子于液氮保存測(cè)定發(fā)芽率和生長(zhǎng)勢(shì)，結(jié)果顯示聚乙烯塑料袋和鋁箔包裝材料好于牛皮紙包裝。

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