• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一株嗜鹽古菌DSFD111的分類學鑒定

    2012-11-14 09:02:54程露露傅金辰楊丹丹張含薇俞姍杉
    關鍵詞:古菌染液菌株

    程露露,傅金辰,楊丹丹,張含薇,俞姍杉,陳 敏

    (杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院,浙江 杭州 310036)

    一株嗜鹽古菌DSFD111的分類學鑒定

    程露露,傅金辰,楊丹丹,張含薇,俞姍杉,陳 敏

    (杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院,浙江 杭州 310036)

    采用形態(tài)學和系統(tǒng)發(fā)育分析對一株嗜鹽古菌DSFD111進行了分類學鑒定.分離到的DSFD111菌株為革蘭氏陰性球菌,不產(chǎn)芽胞,細胞內(nèi)含類脂粒.最適生長溫度為37 ℃, 最適pH為7, 最適生長NaCl濃度為4.3 mol/L,表明該菌株屬于極端嗜鹽菌.根據(jù)16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析,DSFD111菌株歸于鹽盒菌屬(Haloarcula),與最近緣的Haloarculaargentinensis的相似度為99%.

    嗜鹽古菌;菌種鑒定;16S rRNA

    嗜鹽菌(Halophiles)是指生長需要鹽且在一定鹽濃度的環(huán)境中生長最佳的微生物[1].長期的選擇壓力使嗜鹽菌形成了對環(huán)境脅迫的適應機制,能夠產(chǎn)生多種嗜(耐)鹽功能酶及其他特殊性質(zhì)的活性物質(zhì)[2],成為一類新型的、極具應用前景和開發(fā)潛力的極端微生物資源.

    我國的云南、新疆和內(nèi)蒙古等地區(qū)存在著數(shù)量眾多的鹽湖或鹽堿湖,對這類自然高鹽環(huán)境中的嗜鹽微生物已有較多的研究[3-6].而我國東部沿海地區(qū)擁有眾多的鹽田、鹽場,是典型的人工高鹽環(huán)境,對此類環(huán)境中的包括中度嗜鹽菌在內(nèi)的微生物的研究相對還較少[7-9].岱山是浙江省最大的產(chǎn)鹽縣,島上有數(shù)萬畝鹽田,為研究鹽田環(huán)境嗜鹽菌資源提供了極好的條件.2010年,本實驗室從岱山鹽場采集土壤及鹵水樣品,利用選擇性培養(yǎng)基共分離得到181株嗜鹽菌菌株,其中DSFD111菌株經(jīng)檢測具有較高的淀粉酶和脂肪酶活性(結(jié)果已另文報道),本研究主要對DSFD111菌株進行分類學鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析,為進一步的開發(fā)應用提供理論基礎.

    1 材料和方法

    1.1 菌株

    DSFD111菌株:分離自岱山鹽場鹵水樣品,本實驗室保存.

    1.2 培養(yǎng)基

    嗜鹽菌RM培養(yǎng)基:MgSO4·7H2O,20.0 g·L-1;檸檬酸鈉,3.0 g·L-1;KCl,2.0 g·L-1;無水CaCl2,0.2 g·L-1;細菌蛋白胨(L 37),10.0 g·L-1;NaCl,250 g·L-1;瓊脂,15.0 g·L-1;pH 7.0.

    1.3 形態(tài)學鑒定

    1.3.1 菌落形態(tài):取試管斜面保藏的菌種在25% NaCl的RM固體平板培養(yǎng)基上劃線,保鮮膜包覆,倒置在37 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周,觀察平板上單菌落的顏色、大小、形狀、邊緣、表面突起及透明程度等.

    1.3.2 菌體形態(tài)[10]:載玻片上滴1滴已滅菌的25% NaCl溶液,從平板上挑取新鮮培養(yǎng)的菌種,涂片風干后,以2% 的冰乙酸覆蓋5 min固定脫鹽,洗去多余的乙酸并晾干;用結(jié)晶紫覆蓋1~2 min進行簡單染色,蒸餾水洗去染液,晾干,普通光學顯微鏡觀察細胞的形狀,并測定其大小.

    1.3.3 革蘭氏染色:涂片方法同上.革蘭氏染色用結(jié)晶紫初染90 s,水洗,滴加盧戈氏(Lugol’s)碘液沖去殘水,覆蓋1 min,水洗,95%的乙醇滴洗,直至流出的液體不呈紫色,約20~30 s,立即水洗,0.5%番紅水溶液復染1~2 min,水洗,晾干后鏡檢.

    1.3.4 芽孢染色:采用改良Schaeffer-Fulton染色法,取1~2滴無菌鹽水于小試管中,用接種環(huán)挑取培養(yǎng)2周的菌體于該試管中,充分打散混勻,制成濃稠的菌懸液.加2~3滴5% 的孔雀綠染液于小試管中,輕輕搖晃,使染液與菌液充分混合.將小試管用沸水浴加熱15~20 min.用接種環(huán)從試管底部挑取幾環(huán)菌液于潔凈的載玻片上,制成涂片,通過酒精燈火焰2~3次固定,晾干.水洗至流出的水無綠色止.加0.5% 番紅水溶液復染 5 min,傾去染液,用吸水紙吸干.油鏡下觀察.

    1.3.5 類脂粒(PHB)顆粒檢測[11]:按1.3.2的方法制備涂片.蘇丹黑染液染10 min,用水沖去染劑,再用二甲苯?jīng)_洗涂片至無色素洗脫.用0.5%番紅復染1~2 min,水洗,干燥,鏡檢.類脂粒染成藍黑色,菌體其他部分呈紅色.

    1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

    1.4.1 菌體DNA的提取[12]:純化后的單菌落接種至相應NaCl濃度的液體培養(yǎng)基中,37 ℃,180 r/min恒溫光照搖床培養(yǎng)過夜.取1 mL培養(yǎng)好的菌懸液至1.5 mL離心管中,10 000 r/min高速離心5 min,棄去上清液,加無菌水1 mL沖洗,充分旋渦后離心去上清液,重復2次.加雙蒸水100 μL,旋渦震蕩器充分震蕩懸浮,加保鮮膜封口,于沸水浴中煮沸10 min,取出后立即置于冰中.瞬時高速離心,直接取2 μL上清液作為PCR反應模板.

    1.4.2 16S rRNA 擴增:采用古菌通用引物[13]22:5′-ATTCCGGTTGATCCTGC-3′和1540R:5 ′-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3′, PCR反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,30個循環(huán);72 ℃ 10 min.1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,穩(wěn)定電壓90 V,電泳25 min.

    圖1 菌株DSFD111菌落形態(tài)Fig. 1 The colony morphology of strain DSFD111

    1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及分析:PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物公司進行序列測定.測序結(jié)果提交到GenBank得到基因序列登錄號,并通過EzTaxon server 2.1尋找相似性較接近的幾個模式菌株的16S rRNA序列,利用MEGA5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹.

    1.5 生理生化鑒定

    依據(jù)文獻[11,14]中相關內(nèi)容進行.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 形態(tài)學鑒定

    將菌株DSFD111于RM平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)1周后觀察,菌落呈紅色、圓形、直徑約3 mm、表面光滑、邊緣整齊、中間有突起(如圖1).在光學顯微鏡下觀察菌體形態(tài),呈球狀,直徑約1.5 μm.革蘭氏染色陰性,不產(chǎn)芽胞,細胞內(nèi)含類脂粒.

    2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

    擴增菌株DSFD111的16S rRNA基因序列,將PCR產(chǎn)物進行序列測定,測序結(jié)果提交至 GenBank得到基因序列登錄號為JQ068948.查找與該菌株親緣關系較近的已發(fā)表的10個模式菌株的16S rRNA序列,采用MEGA 5.0軟件包中的Kimura 2-Parameter model及Neighbor-Joining法進行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹,結(jié)果如圖2所示.

    圖2 菌株DSFD111 及其近緣種構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree showing the relationship between DSFD111 and the type species in Haloarcula

    結(jié)果表明,菌株DSFD111與Haloarcula屬中的Haloarculaquadrata801030/1T,HaloarculavallismortisCGMCC1.2048T,HaloarculaargentinensisJCM9737T,HaloarculaamylolyticaBD-3T以及HaloarculajaponicaJCM7785T聚為一支,說明與它們都有較近的親緣關系,其中與最近緣的HaloarculaargentinensisJCM9737T的相似度為99%.因此,分子鑒定結(jié)果DSFD111歸于Haloarcula屬.

    2.3 生理生化特征

    根據(jù)分子鑒定結(jié)果,選擇模式菌株HaloarculaargentinensisJCM9737[15]為參照菌株,進行了部分的生理生化試驗,結(jié)果見表1.

    表1菌株DSFD111的生理生化特性
    Tab.1PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofstrainDSFD111

    特性HaloarculaargentinensisJCM9737TDSFD111最適生長NaCl濃度/(mol/L)2.5~3.04.3最適生長溫度/℃4037最適生長pHNR7.0革蘭氏染色--運動性++過氧化氫酶++H2S形成NR-硝酸鹽還原NR+甲基紅試驗NR+伏-普試驗NR+明膠水解++淀粉水解++酪素水解NR-吐溫80++糖發(fā)酵 葡萄糖++ 果 糖NR+ 麥芽糖++ 蔗 糖++ 木 糖NR- 甘露醇-- 甘露糖++ 半乳糖++ 山梨醇-- 核 糖++ α-乳糖--

    +:陽性;-:陰性; NR:未見報道.

    以上結(jié)果表明,DSFD111菌株的主要生理生化特征與Haloarculaargentinensis標準菌株基本吻合.綜合上述形態(tài)、生理生化特性以及16S rRNA基因測序結(jié)果,初步鑒定DSFD111菌株為Haloarculaargentinensis.

    3 討 論

    嗜鹽古菌一般棲居在海水、日光曬鹽池、天然鹽湖或人工腌制食品的表面,在接近飽和的高鹽環(huán)境中,屬優(yōu)勢種群.由于早期的分類鑒定多側(cè)重于形態(tài)和生理生化特性,嗜鹽古生菌的分類地位一直倍受爭議.直到20世紀70年代末三域?qū)W說(Three domains)[16]的提出,把微生物劃分為細菌域(Bacteria)、古菌域(Archaea)、真核生物域(Eukarya)3個分類單元,并從細胞結(jié)構(gòu)、遺傳機制等方面與細菌域和真核生物域相比較,發(fā)現(xiàn)古生菌確實與真細菌和真核生物存在很大不同[17],同時在方法上建立了以16S rRNA基因為指征的序列分析技術(shù),大大推進了古生菌菌種鑒定的相關研究.

    嗜鹽古菌的分類地位歸屬于古菌域(Archaea)、廣古菌門(Euryarchaeota)、鹽桿菌綱(Halobacteria)、鹽桿菌目(Halobacteriales)、鹽桿菌科(Halobacteriaceae),目前僅此一科.1957年,Elazari-Volcani提出了鹽桿菌科的第一個屬,即鹽桿菌屬(Halobacterium)[18].隨后,Gibbons于1974年確立了鹽球菌屬(Halococcus),是鹽桿菌科的第二個屬[19].2001年,伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊依據(jù)16S rRNA基因序列分析結(jié)果、極性脂的組分、細胞形態(tài)及一些其它的表型特征,將鹽桿菌科劃分為15個屬[20].到2009年,該科已包含27個屬,96個正式發(fā)表的種[21].

    本研究對嗜鹽古生菌DSFD111進行了16S rRNA序列同源性分析.擴增結(jié)果與GeneBank上的標準序列進行比對,結(jié)果顯示,DSFD111菌株與Haloarculaargentinensis標準序列比較同源性在99%以上.進一步的生理生化鑒定結(jié)果表明,其主要特征與Haloarculaargentinensis標準菌株基本吻合.因此,初步鑒定DSFD111菌株為Haloarculaargentinensis,是一株極端嗜鹽古生菌.

    [1] 劉志恒.現(xiàn)代微生物學[M].北京:科學出版社,2008:196-201.

    [2] Chen Lei, Wang Guangyu, Bu Tong,etal. Phylogenetic analysis and screening of antimicrobial and cytotoxic activities of moderately halophilic bacteria isolated from the Weihai Solar Saltern (China)[J]. World J Microb Biot, 2010, 26(5):879-888.

    [3] 迪麗拜爾·托乎提,旭格拉,穆爾特扎,等.新疆羅布泊周邊地區(qū)極端環(huán)境嗜鹽菌的研究[J].生物技術(shù),2009,19(5):16-19.

    [4] 柴麗紅,王濤,崔曉龍,等.青海柯柯鹽湖16株細菌的ARDRA篩選及系統(tǒng)發(fā)育初步分析[J].云南大學學報:自然科學版,2003,25(6):541-544.

    [5] 孟凡旭,吳敏,張會斌,等.阿牙克庫木湖嗜鹽菌的分離及功能酶的篩選[J].浙江大學學報:理學版,2006,33(6):671-675.

    [6] 潘海蓮,周成,王紅蕾,等.內(nèi)蒙古錫林浩特地區(qū)嗜鹽古菌多樣性的研究[J].微生物學報,2006,46(1):1-6.

    [7] 田新玉,劉洪燦,郭金昌.青島東風鹽場中極端嗜鹽古細菌的特性[J].應用與環(huán)境生物學報,1998,4(2):175-178.

    [8] 周旭華,王勇,吳敏.舟山地區(qū)嗜鹽菌的分離和產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選[J].浙江大學學報:理學版,2007,34(3):335-339.

    [9] 何敏艷,鄒正中,蔡林,等.連云港臺北和鹽城三圩鹽田土壤嗜鹽菌多樣性研究[J].微生物學通報,2008,35(5):737-742.

    [10] Dussault H P. An improved technique for staining red halophilic bacteria[J]. J Bacteriol, 1955, 70(4):484-485.

    [11] 東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001:349-370.

    [12] 陳敏,趙立平.焦化廢水處理系統(tǒng)中不同培養(yǎng)基分離的細菌種群多樣性[J].微生物學報,2003,43(3):366-371.

    [13] 張萌,張曉梅,竇文芳,等.嗜鹽脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及其粗酶性質(zhì)[J].微生物學通報,2009,36(1):14-19.

    [14] Holt J G, Krieg N R, Sneath P H A,etal. Bergey’s manual of determinative bacteriology[M]. 9th ed. Baltimore: Williams and Wilkins,1994:175-187.

    [15] Ihara K, Watanabe S, Tamura T.Haloarculaargentinensissp. nov. andHaloarculamukohataeisp. nov., two new extremely halophilic archaea collected in Argentina[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 1997, 47(1):73-77.

    [16] Woese C R, Kandler O, Wheelis M L. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya[J].Proc Natl Acad Sci, 1990, 87(12):4576-4579.

    [17] Preseott L M, Harley J P, Klein D A. Microbiology[M]. Boston: McGraw-Hill,2002:442.

    [18] Genus XII.Halobacterium[M]//Elazari-Volcani B. Bergey’s manual of determinative bacteriology. 7th ed. Baltimore: Willians and Wilkins,1957:207-212.

    [19] Gibbons N E. Family V. Halobacteriaceae fam. nov[M]//Buchanan R E, Gibbons N E. Bergey’s manual of determinative bacteriology. 8th ed. Baltimore: Willians and Wilkins,1974:269-273.

    [20] Boone D R, Castenholz R W, Garrity G. Bergey’s manual of systematic bacteriology [M]. New York: Springer-Verlag,2001:1-251.

    [21] Oren A, David R A, Ventosa A. Emended descriptions of genera of the familyHalobacteriaceae[J]. Int J Syst Evol Microbiol,2009,59(3):637-642.

    IdentificationofaHalophilicArchaeaDSFD111

    CHENG Lu-lu, FU Jin-chen, YANG Dan-dan, ZHANG Han-wei, YU Shan-shan, CHEN Min

    (College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

    A halophilic archaea DSFD111 was identified based on morphology and phylogenetic analysis. The strain is Gram-negative bacteria, no spores and contains lipid particles. The best growth environment of the strain is 37 ℃, pH 7 and 4.3 mol/L NaCl, which indicates that the strain is extreme halophiles. The phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene homology shows that the strain belongs toHaloarcula, and shares 99% similarity withHaloarculaargentinensis.

    halophilic archaea; strain identification; 16S rRNA

    2012-07-03

    杭州市科技發(fā)展計劃項目(20101032B26).

    陳 敏(1963—),女,教授,主要從事微生物研究.E-mail:mchen63@163.com

    10.3969/j.issn.1674-232X.2012.06.004

    Q93

    A

    1674-232X(2012)06-0495-05

    猜你喜歡
    古菌染液菌株
    菌株ZYRH-19的篩選鑒定及其合成韋蘭膠的特性研究
    灰樹花工廠化瓶栽菌株篩選試驗
    食用菌(2023年6期)2023-11-28 06:03:32
    不同pH和氧氣條件下土壤古菌與海洋古菌的競爭適應機制*
    土壤學報(2022年3期)2022-08-26 12:15:26
    變油為氣,“榨干”廢棄油田
    大自然探索(2022年5期)2022-07-11 03:10:33
    海洋古菌
    菌株出馬讓畜禽污染物變廢為寶
    基于機器視覺的單組分染液濃度快速檢測方法
    紡織學報(2021年3期)2021-04-06 11:41:18
    蘇木紅/梔子黃/靛藍染色天絲水刺非織造布初探
    東太平洋海隆深海熱液區(qū)沉積物古菌多樣性分析
    原生質(zhì)體紫外誘變選育香菇耐高溫菌株
    午夜精品国产一区二区电影| 天天影视国产精品| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲黑人精品在线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 免费av中文字幕在线| 亚洲中文日韩欧美视频| 18禁观看日本| 大香蕉久久网| 免费在线观看黄色视频的| 美女扒开内裤让男人捅视频| 99国产精品一区二区三区| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 精品卡一卡二卡四卡免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 亚洲成a人片在线一区二区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲av国产av综合av卡| 一级毛片电影观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 美女主播在线视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 考比视频在线观看| 久久精品91无色码中文字幕| 黄色丝袜av网址大全| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产成人欧美| 国产不卡av网站在线观看| 国产福利在线免费观看视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲国产欧美网| 纯流量卡能插随身wifi吗| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 欧美国产精品一级二级三级| 757午夜福利合集在线观看| 精品亚洲成国产av| 久久中文字幕一级| 国产区一区二久久| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲专区中文字幕在线| 午夜福利免费观看在线| 一区在线观看完整版| 人人澡人人妻人| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品免费一区二区三区在线 | 一区二区三区精品91| 成人18禁在线播放| 中文亚洲av片在线观看爽 | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久久久国产一级毛片高清牌| 色视频在线一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区免费| 性少妇av在线| 国产精品影院久久| 久久av网站| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 国产不卡av网站在线观看| 国产一区二区激情短视频| 亚洲九九香蕉| 99精品久久久久人妻精品| 91大片在线观看| 下体分泌物呈黄色| 色在线成人网| 一二三四社区在线视频社区8| 日韩欧美免费精品| 久久精品亚洲av国产电影网| 免费不卡黄色视频| 制服人妻中文乱码| 午夜91福利影院| 一区二区三区激情视频| 在线观看一区二区三区激情| 国产高清激情床上av| 一进一出好大好爽视频| 91av网站免费观看| 视频区图区小说| 午夜免费鲁丝| 在线观看66精品国产| 波多野结衣av一区二区av| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产精品二区激情视频| 日韩视频一区二区在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 国产av精品麻豆| 最黄视频免费看| 婷婷丁香在线五月| 久久久久精品国产欧美久久久| av国产精品久久久久影院| 9热在线视频观看99| 自线自在国产av| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 91九色精品人成在线观看| 在线观看www视频免费| 免费少妇av软件| 12—13女人毛片做爰片一| 嫩草影视91久久| 日韩视频在线欧美| 国产精品av久久久久免费| 免费人妻精品一区二区三区视频| 精品久久蜜臀av无| 国产一区二区 视频在线| 亚洲成人手机| 一本久久精品| 欧美国产精品va在线观看不卡| 欧美精品啪啪一区二区三区| 青草久久国产| 99re在线观看精品视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久精品人人爽人人爽视色| 免费在线观看黄色视频的| 一级毛片女人18水好多| av国产精品久久久久影院| 757午夜福利合集在线观看| 韩国精品一区二区三区| 久久av网站| 夜夜爽天天搞| 波多野结衣一区麻豆| 欧美大码av| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产精品影院久久| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久99一区二区三区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 91精品国产国语对白视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 搡老岳熟女国产| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久99一区二区三区| 国产成人影院久久av| 国产精品成人在线| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲成人免费电影在线观看| avwww免费| 午夜福利免费观看在线| 99riav亚洲国产免费| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 91老司机精品| 色婷婷久久久亚洲欧美| 韩国精品一区二区三区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 夫妻午夜视频| 18禁观看日本| 久久亚洲真实| 日日爽夜夜爽网站| 国产淫语在线视频| 美女主播在线视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 热99久久久久精品小说推荐| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产精品99久久99久久久不卡| 日韩欧美三级三区| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲欧美一区二区三区久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 中国美女看黄片| 久久青草综合色| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲黑人精品在线| 男男h啪啪无遮挡| 在线观看一区二区三区激情| 国产av又大| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 桃花免费在线播放| 久久久久网色| 精品少妇黑人巨大在线播放| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产亚洲一区二区精品| 男女之事视频高清在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 999久久久精品免费观看国产| videosex国产| 国产人伦9x9x在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 大香蕉久久成人网| www日本在线高清视频| 欧美午夜高清在线| 亚洲免费av在线视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 日韩有码中文字幕| 国产精品99久久99久久久不卡| 日韩三级视频一区二区三区| 成人18禁在线播放| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久久国产成人免费| 我要看黄色一级片免费的| a级片在线免费高清观看视频| 午夜老司机福利片| 在线观看免费视频日本深夜| 免费观看av网站的网址| 91大片在线观看| 99久久人妻综合| 久久亚洲精品不卡| 精品熟女少妇八av免费久了| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产高清视频在线播放一区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 色播在线永久视频| 亚洲av美国av| 亚洲精品国产一区二区精华液| 999精品在线视频| 欧美激情高清一区二区三区| 脱女人内裤的视频| 午夜福利一区二区在线看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 五月天丁香电影| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲国产中文字幕在线视频| 美女视频免费永久观看网站| 一夜夜www| 欧美精品av麻豆av| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 99在线人妻在线中文字幕 | 美国免费a级毛片| 在线永久观看黄色视频| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲国产成人一精品久久久| 这个男人来自地球电影免费观看| 在线 av 中文字幕| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 欧美一级毛片孕妇| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美在线一区亚洲| 一区二区三区乱码不卡18| 人妻 亚洲 视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 天堂8中文在线网| 中文亚洲av片在线观看爽 | 99国产精品免费福利视频| 日韩有码中文字幕| 大片免费播放器 马上看| 亚洲伊人色综图| 久久中文字幕人妻熟女| 老司机午夜福利在线观看视频 | 欧美午夜高清在线| 欧美精品一区二区免费开放| 国产av国产精品国产| 日韩欧美国产一区二区入口| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 美女扒开内裤让男人捅视频| 在线观看免费视频日本深夜| 久久毛片免费看一区二区三区| 在线观看免费日韩欧美大片| 高清在线国产一区| 不卡一级毛片| 成年人免费黄色播放视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 热99国产精品久久久久久7| 97在线人人人人妻| 大型av网站在线播放| 99热网站在线观看| 无限看片的www在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 久久免费观看电影| 国产成人av激情在线播放| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 午夜福利在线免费观看网站| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 不卡av一区二区三区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美乱妇无乱码| 成人精品一区二区免费| 无遮挡黄片免费观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久ye,这里只有精品| 亚洲精品中文字幕在线视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产黄色免费在线视频| 青青草视频在线视频观看| 亚洲熟女毛片儿| 成人18禁在线播放| 美女视频免费永久观看网站| 精品免费久久久久久久清纯 | 欧美日韩视频精品一区| 在线观看免费高清a一片| 在线观看免费视频网站a站| 18在线观看网站| 夫妻午夜视频| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美激情 高清一区二区三区| 1024视频免费在线观看| av天堂久久9| 久久婷婷成人综合色麻豆| 成人亚洲精品一区在线观看| 免费不卡黄色视频| 五月天丁香电影| 亚洲视频免费观看视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品少妇内射三级| 在线观看一区二区三区激情| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品一区二区三区av网在线观看 | 91成年电影在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 大片免费播放器 马上看| 嫩草影视91久久| 两性夫妻黄色片| 欧美性长视频在线观看| 黄频高清免费视频| 久久 成人 亚洲| 男女午夜视频在线观看| 1024视频免费在线观看| 下体分泌物呈黄色| 黄色视频不卡| www.精华液| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精品一区二区三区四区五区乱码| 91字幕亚洲| 波多野结衣一区麻豆| 在线观看免费视频日本深夜| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲色图综合在线观看| 在线天堂中文资源库| 欧美久久黑人一区二区| 久久中文看片网| 午夜成年电影在线免费观看| 久久狼人影院| 午夜久久久在线观看| 亚洲美女黄片视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 自线自在国产av| 国产熟女午夜一区二区三区| 另类精品久久| 免费观看a级毛片全部| 国产精品国产高清国产av | 午夜激情av网站| 国产又色又爽无遮挡免费看| 最近最新免费中文字幕在线| xxxhd国产人妻xxx| 国产真人三级小视频在线观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 大片免费播放器 马上看| 久久久欧美国产精品| 99热网站在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲国产av影院在线观看| 国产精品1区2区在线观看. | 久久亚洲精品不卡| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产成人影院久久av| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 黄色片一级片一级黄色片| av免费在线观看网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 久久久久久久精品吃奶| 国产高清国产精品国产三级| 丝袜在线中文字幕| 性色av乱码一区二区三区2| 国产一区二区 视频在线| videos熟女内射| 又大又爽又粗| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品久久久人人做人人爽| 99香蕉大伊视频| 免费日韩欧美在线观看| 深夜精品福利| 亚洲免费av在线视频| 成人特级黄色片久久久久久久 | 亚洲国产av新网站| 老司机在亚洲福利影院| 国产一区二区激情短视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久精品成人免费网站| 日韩一区二区三区影片| 一区二区三区精品91| 亚洲欧美激情在线| 成年人黄色毛片网站| 激情视频va一区二区三区| 国产精品偷伦视频观看了| 麻豆乱淫一区二区| 国产av又大| 999精品在线视频| 欧美日韩视频精品一区| 999久久久国产精品视频| 操出白浆在线播放| www.自偷自拍.com| 成人国语在线视频| 美女午夜性视频免费| 一级片'在线观看视频| 国产xxxxx性猛交| 成人三级做爰电影| 国产精品久久久人人做人人爽| 免费av中文字幕在线| h视频一区二区三区| 高清在线国产一区| 亚洲av美国av| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 无限看片的www在线观看| 国产亚洲精品久久久久5区| 老司机深夜福利视频在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 五月天丁香电影| 亚洲av欧美aⅴ国产| 一级黄色大片毛片| 在线观看免费日韩欧美大片| 少妇粗大呻吟视频| 日本wwww免费看| 国产男靠女视频免费网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 国产午夜精品久久久久久| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 老司机亚洲免费影院| 男女下面插进去视频免费观看| 久久中文字幕一级| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产欧美亚洲国产| 久久精品国产综合久久久| 丝袜美腿诱惑在线| 97人妻天天添夜夜摸| 18在线观看网站| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产欧美日韩一区二区精品| av线在线观看网站| 成人三级做爰电影| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 波多野结衣一区麻豆| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美黑人精品巨大| 久久久久久久久免费视频了| 国产亚洲欧美在线一区二区| 无限看片的www在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 精品福利观看| 久久性视频一级片| 18禁观看日本| 精品久久蜜臀av无| 久久天堂一区二区三区四区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 成人亚洲精品一区在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 欧美成人午夜精品| 中文字幕人妻熟女乱码| 精品亚洲成国产av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 99精品欧美一区二区三区四区| 一级毛片精品| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产成人精品久久二区二区91| 少妇 在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产亚洲精品第一综合不卡| √禁漫天堂资源中文www| 人妻一区二区av| 日日夜夜操网爽| 黄色视频,在线免费观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲一区二区三区欧美精品| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲成国产人片在线观看| 两个人免费观看高清视频| 9色porny在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲视频免费观看视频| 午夜福利视频精品| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产亚洲一区二区精品| 极品人妻少妇av视频| 一区福利在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 91成年电影在线观看| 五月天丁香电影| 超色免费av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 丁香六月天网| 正在播放国产对白刺激| 女人久久www免费人成看片| av不卡在线播放| 99riav亚洲国产免费| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲国产欧美在线一区| 精品乱码久久久久久99久播| 午夜日韩欧美国产| 天天操日日干夜夜撸| 中文亚洲av片在线观看爽 | 精品高清国产在线一区| 69av精品久久久久久 | 操美女的视频在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 51午夜福利影视在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 99久久精品国产亚洲精品| 人妻 亚洲 视频| 日日夜夜操网爽| 天堂中文最新版在线下载| 日韩一区二区三区影片| 精品久久久久久电影网| 久久久精品免费免费高清| 亚洲精品av麻豆狂野| 日本a在线网址| 国产亚洲一区二区精品| e午夜精品久久久久久久| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 免费在线观看日本一区| 久久99一区二区三区| 亚洲专区国产一区二区| 99久久国产精品久久久| 国产淫语在线视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 男女免费视频国产| 国产成人欧美| av网站在线播放免费| 国产在线视频一区二区| 在线 av 中文字幕| 中文字幕人妻熟女乱码| 成年动漫av网址| 丁香六月欧美| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产麻豆69| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 黄色视频不卡| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 性少妇av在线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久热爱精品视频在线9| 亚洲一码二码三码区别大吗| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 大香蕉久久网| 成人影院久久| 久久久国产欧美日韩av| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 午夜福利一区二区在线看| 69精品国产乱码久久久| 国产亚洲精品一区二区www | 欧美大码av| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 免费观看人在逋| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 丁香六月天网| 一区二区av电影网| 国产精品1区2区在线观看. | 精品欧美一区二区三区在线| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 十八禁人妻一区二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 女性被躁到高潮视频| 国产欧美亚洲国产| 欧美中文综合在线视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产片内射在线| 日本欧美视频一区| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产成人影院久久av| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产av精品麻豆| 中文字幕av电影在线播放| 欧美午夜高清在线| 亚洲免费av在线视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久久久久久久久久久大奶| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 在线看a的网站| 99国产精品99久久久久| 99在线人妻在线中文字幕 | 母亲3免费完整高清在线观看| 一本久久精品| 女人久久www免费人成看片| 久久ye,这里只有精品|