RP-HPLC法測定益肺通絡顆粒中巖白菜素的含量

劉紅宇 楊勵 曾建國

1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，湖南長沙 410007；2.湖南省長沙市中心醫(yī)院，湖南長沙 410004

RP-HPLC法測定益肺通絡顆粒中巖白菜素的含量

劉紅宇1楊勵2曾建國2

1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，湖南長沙 410007；2.湖南省長沙市中心醫(yī)院，湖南長沙 410004

目的建立益肺通絡顆粒有效成分巖白菜素的含量測定方法。方法采用RP-HPLC法，Agillent高效液相色譜儀，Kromasil ODS（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；甲醇-水（20∶80）為流動相；流速為1mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為275 nm；靈敏度為0.05 AUFS。進樣量10μL。結(jié)果在該方法中，巖白菜素進樣量在0.054～0.540μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，r=0.999 06，平均回收率為98.53%，RSD為1.32%。結(jié)論本方法準確簡便，準確，重復性好，可用于益肺通絡顆粒中有效成分巖白菜素的含量測定。

益肺通絡顆粒；巖白菜素；含量測定；高效液相色譜法

益肺通絡顆粒由黃精、百部、天冬、鱉甲、白及、矮地茶、絲瓜絡、紫花地丁、太子參、款冬花、大薊11味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、化瘀通絡、去腐生新的功效，主治氣陰兩虛夾瘀型肺結(jié)核。處方中除鱉甲單煎外，其余十味藥全部煎煮提取，合并二煎液濃縮制成顆粒。方中矮地茶化痰止咳，清利濕熱，活血化痰。全株主含揮發(fā)油0.1%～0.2%，在去油后的殘渣中分離得鎮(zhèn)咳有效成分矮茶素1號（即巖白菜素，bergenin）和矮茶素2號，尚含2-羥基-5-甲氧基-3-十五烯基苯醌等化合物及三萜類化合物。其活性成分矮茶素1號對電刺激貓喉上神經(jīng)所引起的咳嗽及氨水噴霧引起的小鼠咳嗽都有明顯的止咳作用[1]；矮地茶有降低大鼠氣管-肺組織耗氧量的作用，矮茶素1號作用于含硫氫基必需基團的酶體系，因而降低了組織呼吸；每日吸入二氧化硫產(chǎn)生慢性氣管炎的大鼠，內(nèi)服矮茶素1號有一定的預防及治療作用，表現(xiàn)為杯狀細胞減少、炎細胞浸潤、肺氣腫及肺萎縮程度減輕[2-3]。為控制益肺通絡顆粒中矮地茶的質(zhì)量，本文在綜合相關(guān)色譜分析方法的基礎上[4-7]，建立了益肺通絡顆粒中巖白菜素的RP-HPLC含量測定方法，為益肺通絡顆粒中矮地茶的質(zhì)量控制提供了方法和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agillent高效液相色譜儀，色譜柱KromasilODS（250mm× 4.6 mm，5μm）；超聲波清洗器（KQ-600型）；萬分之一電子分析天平。

1.2 試劑及樣品

試劑：甲醇為色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司，20110406），水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。巖白菜素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：1532-200202）。益肺通絡顆粒（自制，批號：110605、110615、110625）

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性

Kromasil ODS（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱；甲醇-水（20∶80）為流動相；流速為1 mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為275 nm；靈敏度為0.05 AUFS，理論塔板數(shù)大于3 000，拖尾因子（T）為0.940。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的巖白菜素5.4mg，用甲醇溶解制成0.054mg/mL的對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備取本品顆粒約0.5 g，精密稱定，置入50mL量瓶中，加入甲醇40mL，超聲處理40min，放冷后加入甲醇至刻度，濾過，取續(xù)濾液10μL進樣，測定。

2.2.3 陰性溶液的制備按本品制劑工藝制備不含矮地茶的制劑，同供試品溶液制備方法制備，進樣量同上，測定。各溶液色譜見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取巖白菜素對照品溶液（0.054 mg/mL）1、2、4、6、8、10μL進樣。測定其峰面積，以峰面積值（A）對進樣量（C）進行回歸，得標準曲線方程A=63.705 84C-1.775 24（r= 0.999 06）。以上結(jié)果表明，在0.054～0.540μg范圍內(nèi)，巖白菜素峰面積值與進樣量有良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗

精密吸取上述對照品溶液8μL，重復進樣6次，測定巖白菜素峰面積，結(jié)果分別為497.22、510.34、509.00、504.60、508.24、507.02，RSD為0.94%。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液（批號：110615）在0、1、2、4、8、24 h，分別進樣8μL，測定樣品中巖白菜素峰面積，結(jié)果分別為175.47、176.54、175.64、177.67、178.40、174.48，RSD為0.83%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗

按擬定的含量測定方法，對同一批樣品（批號：110615）分別制備供試品溶液，測得峰面積值并計算含量，RSD為1.47%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：110615）約0.1 g，分別加入對照品溶液（0.054 mg/mL）3 mL，按上述樣品制備方法和色譜條件，制備加樣回收供試品溶液并注入高效液相色譜儀，計算回收率。見表1。試驗結(jié)果表明，此方法可靠性良好。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.8 樣品測定

取3批樣品，按供試品溶液制備方法操作，按擬定的色譜條件測定其峰面積，每批樣品測定6份，結(jié)果取平均值，3批樣品中巖白菜素的含量分別為1.76、1.67、1.84 mg/g，見表2。

表2 樣品中巖白菜素含量測定結(jié)果

3 討論

矮地茶為本方主藥之一，且用量較大，其功用化痰止咳，清利濕熱，活血化痰，符合本方益肺通絡的中醫(yī)基本理論，巖白菜素為矮地茶的有效成分之一，故選擇巖白菜素作為控制本品質(zhì)量的指標成分。

在巖白菜素的高效液相色譜法試驗中，在對巖白菜素進行全波長掃描中，發(fā)現(xiàn)該化合物有2個吸收峰，分別位于220 nm和275 nm，考慮流動相中甲醇在220 nm波長處對基線有影響，故試驗中檢測波長選擇為275 nm[8]，參照《中國藥典》2010年版[9]及相關(guān)文獻[10-12]，流動相考察了甲醇-水（15∶85），甲醇-水（20∶80），甲醇-水（25∶75）等，系統(tǒng)流速設置為1.0 mL/min，試驗結(jié)果顯示用甲醇-水（15∶85）洗脫，出峰時間超過20min，而用甲醇-水（25∶75）來洗脫則出現(xiàn)與其他峰相隔較近及基線不平現(xiàn)象，最后選用甲醇-水（20∶80）為流動相，色譜圖中巖白菜素的保留時間為12min左右，峰形較好，且無其他雜質(zhì)峰干擾；供試品制備考察中，則對不同的超聲時間（30、40、50min）作了比較，結(jié)果表明40min和50min測得的含量相差不大，30 min得出的含量較低，故采用超聲40min為宜。試驗結(jié)果表明該方法具有分離效果好、靈敏度高、準確度高等優(yōu)點，可作為益肺通絡顆粒的質(zhì)控方法。

[1]呂修梅，王軍憲.巖白菜屬植物的研究進展[J].中藥材，2003，26（1）：58.

[2]劉偉林，楊東愛，余勝民，等.矮地茶藥理作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（12）：3002-3003.

[3]陳少鋒，楊東愛，余勝民，等.矮地茶水提物及醇提物急性毒理學研究[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2008，17（11）：3-4.

[4]付成效，劉高峰，鄒渭洪，等.反相高效液相色譜法測定生地茶止咳合劑中巖白菜素的含量[J].中南藥學，2012，10（2）：96-98.

[5]姚雪蓮，蘇明武.銀仙通肺寶顆粒中巖白菜素的提取工藝優(yōu)選[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（19）：29-31.

[6]金楊，王燕.正交試驗優(yōu)選復方巖白菜素滴丸制備工藝[J].中國藥房，2011，22（7）：614-615.

[7]龍海燕，李慧，黃曉燕，等.HPLC測定復方矮地茶片中巖白菜素的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16（9）：41-43.

[8]周興旺，陳忠，葉劍良，等.天然產(chǎn)物巖白菜內(nèi)酯化學結(jié)構(gòu)的二維NMR研究[J].廈門大學學報：自然科學版，1999，38（6）：947-9501.

[9]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：338.

[10]周文梟，崔德斌.高效液相色譜法測定抗癆膠囊中巖白菜素的含量[J].醫(yī)藥導報，2004，23（10）：777-778.

[11]鄧茂芳，田永華.HPLC法測定矽肺寧片中巖白菜素的含量[J].中國藥品標準，2005，6（2）：22-23.

[12]丁家欣，張秋海，張黔，等.HPLC法測定不同產(chǎn)地與采收期虎耳草中巖白菜素的含量[J].中國中藥雜志，2002，27（10）：792.

RP-HPLC determ ination of bergenin in Yifei Tongluo Granules

LIU Hongyu1 YANG Li2 ZENG Jian'guo2
1.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital to Hu′nan University of Chinese Medicine,Hu′nan Province, Changsha 410007,China;2.The Central Hospital in Changsha City,Hu′nan Province,Changsha 410004,China

ObjectiveTo establish amethod for determination of bergenin in compound Yifei Tongluo Granules.MethodsThe RP-HPLC method was adopted.The Kromasil ODS column(4.6 mm×250 mm,5μm)was used at the column temperature of 30℃.The mobile phase consisted ofmethanol-water(20∶80)with the flow rate of 1.0 mL/min and the detection wavelength was 275 nm.ResultsThere was a good linear relationship between the peak area and the sample size of bergenin within the range of 0.054-0.540μg,r=0.999 06,and the average recovery rate was 98.53%with the RSD of 1.32%(n=6).ConclusionThemethod is simple,accurate and repeatable,which can be used for the quality control of Yifei Tongluo Granules.

Yifei Tongluo Granules;Bergenin;Content determination;HPLC

R927

A

1673-7210（2012）10（c）-0108-03

2011年度湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（項目名稱：“益肺通絡顆粒”的研制；項目編號：201113）。

劉紅宇（1973.1-），女，湖南長沙人，博士研究生，副主任藥師，主要從事中藥質(zhì)量標準研究。

曾建國，男，湖南長沙人，本科，主任藥師，主要從事新藥研發(fā)工作。

2012-07-25 本文編輯：衛(wèi)軻）