一起由非脫羧勒克菌引起食物中毒的調查和實驗室檢驗與分析

伍海燕 宋燕 張萍 姜照 王培娟 王彥青 寧文吉 韓文清▲

1.山東省煙臺市疾病預防控制中心，山東煙臺 264003；2.山東省煙臺市開發(fā)區(qū)疾病預防控制中心，山東煙臺 264006

一起由非脫羧勒克菌引起食物中毒的調查和實驗室檢驗與分析

伍海燕1宋燕1張萍1姜照1王培娟2王彥青1寧文吉1韓文清1▲

1.山東省煙臺市疾病預防控制中心，山東煙臺 264003；2.山東省煙臺市開發(fā)區(qū)疾病預防控制中心，山東煙臺 264006

目的對一起食物中毒的采集樣本進行相關微生物學檢驗，確定引起食物中毒的病原菌，并進行16S rRNA序列分析確定其歸屬。方法根據流行病學調查及臨床表現(xiàn)，選擇疑似的病原菌，根據GB/T4789-2003、GB/T4789-2008、GB/T4789-2010、WS/T9-1996、《衛(wèi)生防疫細菌檢驗》對采集的樣品進行病原菌分離與鑒定，對菌株的16S rRNA基因測序結果進行分析。結果從1份疑似中毒食物魚香茄子中檢出非脫羧勒克菌，該菌株屬于阿氏腸桿菌。結論綜合流行病學調查、臨床資料和實驗室檢測結果，提示該次食物中毒由非脫羧勒克菌污染食物所致。

食物中毒；非脫羧勒克菌；污染

非脫羧勒克菌是屬于勒克菌屬中唯一的菌種，在1986年提議命名，是一種罕見的腸桿菌科細菌，該細菌能夠在動物、植物、食物和水等環(huán)境中生存，也能在一些臨床樣本中分離到，如血液、糞便、痰液和尿液等。非脫羧勒克菌在一定條件下可以成為對人體具有致病力的病原菌，并與人類腹瀉關系密切，有報道曾在腹瀉患者糞便和痰液中檢出，對小白鼠有一定致病力[1]。

1 流行病學調查

2011年8月3日山東省煙臺市疾病預防控制中心接到報告，本市某企業(yè)餐廳就餐職工相繼出現(xiàn)腹瀉、腹痛、嘔吐等癥狀。該公司位于煙臺市區(qū)西部，現(xiàn)有員工約8萬人，公司園區(qū)供餐場所共計57個，廠區(qū)有員工餐廳37個，中央廚房3個，主要有3家餐飲供應商。首發(fā)病例時間為2011年8月2日12∶00時左右，發(fā)病高峰出現(xiàn)在同年8月3日00∶00～9∶10，此時間段共有42例發(fā)病。截至8月3日15∶00共有45例發(fā)病，潛伏期12～30 h。45例發(fā)病者主要臨床癥狀為腹瀉45例，腹痛43例，惡心39例，嘔吐32例，嘔吐次數以3～5次/d為主，部分患者有發(fā)熱癥狀，少數頭痛、頭暈，癥狀較輕，但反復遷延，未出現(xiàn)異常神經和精神癥狀。腹瀉物性狀以黃色米泔水樣便為主，腹瀉次數以3～10次/d為主，腹痛主要為上腹部和臍周絞痛，經及時補液和抗菌治療后發(fā)病者情況均逐步緩解。

2 方法與結果

2.1 樣品來源

流調現(xiàn)場采集179份剩余食物樣品，10份大便，2份嘔吐物。

2.2 培養(yǎng)基試劑及診斷血清

本次試驗用培養(yǎng)基、生化試劑均來自北京陸橋技術責任有限公司；腸桿菌科和其他非苛養(yǎng)革蘭陰性桿菌鑒定試劑盒ID32E，由法國梅里埃提供；沙門菌屬診斷血清、志賀菌屬診斷血清均由寧波天潤生物藥業(yè)有限公司提供。Taq DNA聚合酶、dNTPsDNA、Marker、pmD18-T載體均購自Takara公司；全血基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒均購于天根公司；DH5ɑ購自大連寶生物公司。所有培養(yǎng)基和試劑均在有效期內使用。

2.3 檢驗項目和方法

根據流行病學調查及臨床表現(xiàn)，主要檢測沙門菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌。檢測方法按GB/T4789-2003、GB/T4789-2008、GB/T4789-2010《中華人民共和國國家標準——食品衛(wèi)生微生物學檢驗》[2]和《衛(wèi)生防疫細菌檢驗》[3]對采集的樣品進行檢測，同時采用法國梅里埃ATB微生物自動鑒定系統(tǒng)進行細菌鑒定。

2.4 病原菌分離鑒定[4]

2.4.1 分離培養(yǎng)將采集的樣品直接劃線接種HE平板、TCBS平板、哥倫比亞血平板；同時分別接種緩沖蛋白胨水（BPW）、GN增菌液、7.5%氯化鈉肉湯、3%氯化鈉堿性蛋白胨水，18～24 h增菌培養(yǎng)后劃線接種以上選擇性平板。培養(yǎng)后接種的相關選擇性培養(yǎng)基上未發(fā)現(xiàn)沙門菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌的可疑菌落，但在HE平板上發(fā)現(xiàn)了菌落形態(tài)一致的疑似志賀菌菌落。

2.4.2 生物特征在HE平板上的典型菌落較小，圓形、光滑、凸起、透明、無色。挑起HE平板上的可疑菌落接種TSI斜面培養(yǎng)18～24 h，底層變黃無氣體，斜面變紅。經革蘭染色和鏡檢，菌落呈G-，短小無芽孢桿菌。

2.4.3 生化鑒定上述優(yōu)勢菌株純化后接種腸桿菌科細菌鑒定系統(tǒng)，生化反應結果見表1。

表1 生化鑒定結果

2.4.4 儀器分析上述分離純化的優(yōu)勢菌株同時也接種腸桿菌科和其他非苛養(yǎng)革蘭陰性桿菌鑒定試劑盒ID32E，采用法國梅里埃ATB微生物自動鑒定系統(tǒng)進行細菌鑒定，生化反應如表2所示，鑒定結果（124號樣品）為非脫羧勒克菌，%id= 99.6，T=0.97。

2.4.5 血清學試驗上述志賀菌疑似菌落純化后分別與志賀菌屬診斷血清凝集反應，結果顯示與痢疾5-8型血清發(fā)生交叉凝集。

2.4.6 病原菌分離鑒定結果根據分離培養(yǎng)特性、生化試驗和血清學試驗結果：179份剩余食物樣品中，從1份魚香茄子中檢出非脫羧勒克菌，10份大便，2份嘔吐物未檢出。

2.5 16 S rRNA基因的PCR擴增

2.5.1 引物設計根據GenBank登錄的原核生物16S rRNA基因設計通用引物，上游引物為27F：5’-gWATTACCgCggCK-gCTg-3’；下游引物為519R：5’-gWATTACCgCggCKgCTg-3’。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，預計擴增片段長度為500 bp左右。

2.5.2 全基因組提取刮取經純培養(yǎng)的非脫羧勒克菌菌落，嚴格按試劑盒說明書進行DNA提取。

2.5.3 16 S r RNA基因的PCR擴增通過設計合成的原核生物16S rRNA基因，設計通用引物對所提取的全基因組DNA進行PCR擴增。PCR反應體系總體積為50μL，其中，Mix Buffer 25μL，27F 2μL，519R 2μL，ddH2O 16μL，DNA 5μL。程序PCR如下：94℃變性5min；接著按以下程序循環(huán)30次：94℃變性30 s，52℃復性30 s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

2.5.4 PCR擴增結果采用BLAST軟件將測序菌株16S rRNA序列與GenBank數據庫中相關菌株的16S rRNA序列進行同源性比較，結果與阿氏腸桿菌LF7a的同源性達99.8%，可認定為同一個種。

3 討論

本次腹瀉經過流行病學調查，結合臨床癥狀及實驗室檢驗結果，懷疑可能是由非脫羧勒克菌污染食物所致。在實驗室檢驗中，未檢出沙門菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌。病原菌污染及混合污染食物而引起食物中毒導致腹瀉的事件時有報道[5-6]，但是罕見的非脫羧勒克菌污染食物在煙臺地區(qū)尚屬首例。

本研究分離菌，形態(tài)、生化特征與已有報道基本符合，故可初步定為非脫羧勒克菌。根據菌株的16S rRNA基因測序結果進行同源性分析，采用MEGA 4.0軟件的Neighbor-Joining方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據各項結果，初步鑒定YT-1107菌株屬于腸桿菌屬（Enterobacter），與菌株阿氏腸桿菌LF7a為同一物種。

在本次檢驗過程中，觀察非脫羧勒克菌在HE平板上生長表現(xiàn)出的生物特征與志賀菌極為相似，且與其血清發(fā)生交叉凝集，易誤判，但生化反應結果與志賀菌不同，結合全自動微生物鑒定系統(tǒng)分析結果，最終判定為非脫羧勒克菌。近年來，關于非脫羧勒克菌在臨床[7]、食品[8]中被檢出的報道增多，但仍然缺乏對其全面系統(tǒng)的研究[9]，建議重視該菌的分類地位和臨床價值，為防范其在食品安全方面的潛在風險提供詳實依據。

食品安全問題關系每個人的切身利益。保障食品安全，減少食物中毒事件的發(fā)生，首先要加強對食品安全領域的監(jiān)管力度，包括食品的生產、加工、銷售等環(huán)節(jié)；其次要通過宣傳等方式提高公眾的食品衛(wèi)生安全意識；最后要完善食品安全風險評估體系的建設，確定危害因素的分布和可能來源，及時發(fā)現(xiàn)食品安全隱患，進行風險預警。

表2 全自動生化鑒定結果

[1]陳偉峰，洪舒音，趙秀玲.速凍南瓜泥中檢出罕見的非脫羧勒克菌[J].食品科技，2010，35（12）：311-313.

[2]GB/T4789-2003/2008/2010.中華人民共和國國家標準——食品衛(wèi)生微生物學檢驗[S].北京：中國標準出版社.

[3]何曉青.衛(wèi)生防疫細菌檢驗[M].北京：新華出版社，1989：301，479.

[4]唐珊熙.微生物學及微生物學檢驗[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1998： 175-176.

[5]高亞色，李恩.一株由奇異變形桿菌和倫敦沙門菌引起食物中毒的實驗室檢驗[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011，21（9）：2222-2223.

[6]陳玉貞.食源性病原微生物流行病學特點及實驗室診斷[M].天津：天津科學技術出版社，2010：61-66.

[7]王遷，馬金群.從血液標本中分離到1株非脫羧勒克菌[J].中華醫(yī)院感染學志，2008，18（4）：578.

[8]杜強，錢紅.從真空包裝食品中檢出罕見的非脫羧勒克菌[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，15（4）：502-503.

[9]陳太基，封幼玲，王為云，等.一株非脫羧勒克氏菌的分離鑒定報告[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，1997，7（2）：120.

Laboratory test and analysis on a food poisoning event due to contam ination w ith Leclercia adecarboxylata

WU Haiyan1 SONG Yan1 ZHANG Ping1 JIANG Zhao1 WANG Peijuan2 WANG Yanqing1 NING Wenji1 HAN Wenqing1▲
1.Yantai Centers for Disease Control and Prevention,Shandong Province,Yantai 264003,China;2.Yantai Development Zone Centers for Disease Control and Prevention,Shandong Province,Yantai 264006,China

ObjectiveTo conductmicrobiological test of samples collected from a food poisoning event,in order to identify the pathogen caused food poisoning,analyze 16S rRNA sequence and identify its ownership.MethodsAccording to epidemiological investigation and clinical manifestation,suspected pathogens were selected.According to GB/T4789-2003, GB/T4789-2008,GB/T4789-2010,WS/T9-1996 and Bacteriological Inspection for Health and Disease Prevention, pathogens were isolated from samples and identified.The results of 16S rRNA gene sequencing of strains were analyzed. Results Leclercia adecarboxylata was detected out from 1 suspicious food sample of braised eggplant.The pathogen belonged to Enterobacter asburiae.ConclusionIntegration of epidemiology investigation,clinical data and laboratory test results,This food poisoning event is caused by contamination with Leclercia adecarboxylata.

Food poisoning;Leclercia adecarboxylata;Pollution

R155.3+1

C

1673-7210（2012）11（c）-0136-03

伍海燕（1965-），女，副主任技師，主要從事食品微生物檢驗方面研究。

▲通訊作者

2012-07-27 本文編輯：程銘）