JNK2在早期糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)及作用

張曙光 何 躍 項(xiàng) 杰 馬林昆 李 燕 袁援生

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見(jiàn)的眼部并發(fā)癥，是DM患者致盲的主要原因之一。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)DR的研究主要集中在視網(wǎng)膜毛細(xì)血管微循環(huán)的改變上，對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的研究較少。事實(shí)上，視網(wǎng)膜是由血管和神經(jīng)元組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，主要由神經(jīng)網(wǎng)膜組成，神經(jīng)細(xì)胞是神經(jīng)網(wǎng)膜的主要成分，血管組織僅占很少一部分。20世紀(jì)80年代中期已有學(xué)者提出DR的主要發(fā)病機(jī)理可能不僅是視網(wǎng)膜血管本身，還與血管周?chē)纳窠?jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)組織相關(guān)，且關(guān)系更為密切。因此，神經(jīng)網(wǎng)膜的研究對(duì)早期DR的預(yù)防及減少其并發(fā)癥的發(fā)生具有重要價(jià)值，阻斷并減少早期視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，研究其在DR中的凋亡機(jī)制，對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)和早期治療具有重要意義。JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族成員，它是參與凋亡過(guò)程的重要基因之一[1-3]，其在DM中的作用也日益受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察JNK2在DM早期視網(wǎng)膜中的表達(dá)變化及其對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響，初步探討JNK2在糖尿病視網(wǎng)膜中的作用及與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為進(jìn)一步了解DM早期視網(wǎng)膜組織的變化奠定基礎(chǔ)，從而為預(yù)防早期DR的發(fā)生及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司)，檸檬酸、檸檬酸鈉、雅培安妥超越血糖試紙(美國(guó)GBI公司)，Trizol(美國(guó)Trireagent公司)，cDNA合成試劑盒(美國(guó)Fermentas公司)，2×PCR master mix(美國(guó)Fermentas公司)，TBE Buffer、瓊脂糖、基因表達(dá)試劑盒(美國(guó)ABI公司)，Taqman基因表達(dá)預(yù)混試劑盒 (美國(guó)ABI公司)，GAPDH、JNK2引物(上海生工)，DNA Loading buffer(美國(guó) Fermentas公司)，凋亡試劑盒(Millipore公司)，蛋白酶K(大連寶生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取 6～8周雄性C57BL/6小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，由重慶動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，粗顆粒飼料，清潔水喂養(yǎng)，室溫控制在15～25℃，在無(wú)特定病原體的環(huán)境下飼養(yǎng)，隨機(jī)分為正常組18只和DM組42只。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立及血糖測(cè)定 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h以上，按150 mg·kg-1體質(zhì)量的劑量，一次性快速腹腔注射新鮮配制的5 g·L-1STZ緩沖液(用 pH 值4.4 的0.1 mol·L-1無(wú)菌檸檬酸緩沖液配制)，正常組腹腔注射同體積的0.1 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH值4.4)。造模后3 d，在小鼠禁食12 h后測(cè)尾靜脈血糖，空腹血糖＞11.1 mmol·L-1為造模成功，同時(shí)觀(guān)察體質(zhì)量及尿量變化。未達(dá)到血糖標(biāo)準(zhǔn)的小鼠及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中血糖降低者不作為實(shí)驗(yàn)組對(duì)象。正常組和DM組小鼠在造模后2周、4周、8周時(shí)分別行尾靜脈采血測(cè)空腹血糖，其中正常組分別為(8.25 ±1.05)mmol·L-1、(7.73 ± 1.49)mmol·L-1、(7.33 ± 0.96)mmol·L-1，DM 組分別為(24.94 ± 2.43)mmol·L-1、(23.36 ± 3.63)mmol·L-1、(21.18 ± 5.92)mmol·L-1。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR 于造模后2周、4周、8周分別處死正常組小鼠6只，DM組小鼠14只，并取雙眼眼球置于液氮中備用。在液氮中取出各組小鼠左眼眼球，高倍顯微鏡下完整取出視網(wǎng)膜后，采用Trizol試劑提取視網(wǎng)膜中的總RNA，用紫外分光光度儀測(cè)OD260及OD280值，同時(shí)取出部分RNA用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度是否有降解。本實(shí)驗(yàn)的視網(wǎng)膜總RNA鑒定結(jié)果均證明其條帶完整。取RNA，按照cDNA合成試劑盒說(shuō)明合成cDNA，并檢測(cè)其可用性。JNK2引物通過(guò)Primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)，盡量減少發(fā)卡結(jié)構(gòu)和二聚體的存在，所設(shè)計(jì)引物通過(guò)Blast軟件檢測(cè)其產(chǎn)物正確，內(nèi)參照基因GAPDH由美國(guó)Fermentas公司設(shè)計(jì)生產(chǎn)，JNK2引物序列:上游 5’-TTGATACAGTTCTTGGGATA-3’，下游5’-TTGAGGGTACAGTCTGATTT-3’，產(chǎn)物 367 bp;內(nèi)參照基因GAPDH序列:上游5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’，下 游 5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’，產(chǎn)物 496 bp。Taqman探針由美國(guó)ABI公司設(shè)計(jì)合成，實(shí)時(shí)定量反應(yīng)體系20 μL，使用ABI公司的7300PCR熒光定量擴(kuò)增儀進(jìn)行。擴(kuò)增條件:50℃ 2 min，循環(huán)1次;95℃ 10 min，循環(huán)1次;95℃ 15 s，循環(huán)40次;60℃ 1 min，循環(huán)40次。實(shí)時(shí)定量RT-PCR的結(jié)果以Ct值顯示，基因表達(dá)的差異采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。

1.2.4 TUNEL染色 取小鼠右眼做冰凍切片，以視神經(jīng)軸為中心，做連續(xù)矢狀切面，切片厚度5 μm，每個(gè)眼球切2-3張片，每張切片取3個(gè)截面，并用40 g·L-1多聚甲醛(pH=7.4)室溫下固定，按TUNEL凋亡試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性及陰性對(duì)照組，以提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。TUNEL染色后每個(gè)視網(wǎng)膜標(biāo)本取2張切片，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察切片，細(xì)胞核呈棕黃色、棕褐色著染者為陽(yáng)性，細(xì)胞核呈綠色著染者為陰性。200倍光學(xué)顯微鏡下連續(xù)計(jì)數(shù)5個(gè)視野100個(gè)視網(wǎng)膜細(xì)胞數(shù)和染色為陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 HE染色 冰凍切片經(jīng)福爾馬林固定，蒸餾水漂洗，蘇木素及伊紅染色并經(jīng)不同濃度的乙醇脫水后二甲苯固定，中性樹(shù)膠封片，200倍光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察視網(wǎng)膜各層細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的變化，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)為每高倍顯微鏡視野下所看到的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較如符合正態(tài)分布用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，如不符合采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn);組內(nèi)比較用單因素方差分析，如方差分析有差異，兩兩之間比較用Bonferroni檢驗(yàn)，如方差不齊采用多個(gè)獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)(H檢驗(yàn))。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果 GAPDH和JNK2的擴(kuò)增曲線(xiàn)均呈S型，顯示擴(kuò)增效果良好。不同時(shí)間點(diǎn)正常組和DM組JNK2基因表達(dá)水平見(jiàn)表1。由表1知，JNK2在正常組隨時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯變化(P＞0.05)，而在DM組隨時(shí)間延長(zhǎng)上調(diào)倍數(shù)顯著增加(P ＜0.05)。

2.2 TUNEL染色結(jié)果 凋亡陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞核或細(xì)胞漿染色呈棕黃色，陰性細(xì)胞因甲基綠染色細(xì)胞核呈綠色。結(jié)果顯示，正常組小鼠視網(wǎng)膜各層內(nèi)可見(jiàn)少量神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡;DM組4周時(shí)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見(jiàn)少量的凋亡細(xì)胞，8周時(shí)凋亡細(xì)胞明顯增多，內(nèi)核層和外核層也可見(jiàn)凋亡細(xì)胞(圖1)。不同時(shí)間點(diǎn)正常組和DM組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率情況見(jiàn)表2。由表2知，正常組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡率隨時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯變化(P＞0.05)，DM組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡率隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯增加(P＜0.05)。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)兩組JNK2基因表達(dá)水平Table 1 JNK2 gene expression in two groups at different time points (ρ/g·L-1)

表2 不同時(shí)間點(diǎn)兩組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率Table 2 Retinal ganglion cell apoptosis rate in two groups at different time points (apoptosis rate/%)

Figure 1 TUNEL staining of each retinal layer in DM group at different time points(×200).A:2 weeks;B:4 weeks;C:8 weeks 不同時(shí)間點(diǎn)DM組小鼠視網(wǎng)膜各層的TUNEL染色結(jié)果(×200)。A:2周;B:4周;C:8周

2.3 HE染色結(jié)果 正常組小鼠可見(jiàn)視網(wǎng)膜分層清晰，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列整齊，內(nèi)叢狀層染色較均勻，內(nèi)核層和外核層細(xì)胞排列較整齊。DM組小鼠在建模后4周時(shí)與正常組比較視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整，視網(wǎng)膜分層稍紊亂，細(xì)胞形態(tài)正常，但較稀疏;8周時(shí)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少較明顯，神經(jīng)纖維層及內(nèi)叢狀層變薄，內(nèi)核層細(xì)胞排列較紊亂，外叢狀層厚度亦變薄(圖2)。兩組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)情況見(jiàn)表3。由表3知，正常組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)明顯變化(P＞0.05)，DM組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少(P＜0.05)。

Figure 2 HE staining of each retinal layer in DM group at different time points(×200).A:2 weeks;B:4 weeks;C:8 weeks 不同時(shí)間點(diǎn)DM組小鼠視網(wǎng)膜各層的HE染色結(jié)果(×200)。A:2周;B:4周;C:8周

表3 不同時(shí)間點(diǎn)兩組每高倍視野神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)Table 3 Retinal ganglion cell number in two groups at different time points under high power field

3 討論

JNK2是絲裂原激活蛋白激酶家族成員之一，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[4-5]，在不同的應(yīng)激環(huán)境中，JNK2可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6-7]，也可抑制細(xì)胞凋亡[8]。目前研究發(fā)現(xiàn)，JNK2在DM病程中扮演著重要角色。Jaeschke等[9]通過(guò)建立自身免疫性DM的非肥胖型小鼠模型來(lái)研究JNK2在DM中所扮演的角色，發(fā)現(xiàn)JNK2在該類(lèi)小鼠CD4+T細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用，JNK2基因敲除可提高β細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗，減少胰島的破壞，延緩DM的疾病進(jìn)展;Yang等[10]研究發(fā)現(xiàn)在 C57BL/6 DM 小鼠，JNK2的表達(dá)增加能夠激活胚胎細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致畸胎的發(fā)生;Ijaz等[11]研究發(fā)現(xiàn)在DM小鼠中敲除JNK2能夠增加胰島素的靈敏度，降低尿蛋白水平等。

DR是DM的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，阻斷JNK2能夠增加胰島素的敏感性，從而延緩DM的發(fā)展[9]，然而，JNK2在DM小鼠視網(wǎng)膜中的研究國(guó)內(nèi)外均未查見(jiàn)報(bào)道。我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法發(fā)現(xiàn)在DM小鼠視網(wǎng)膜中同樣存在JNK2的表達(dá)，DM組小鼠與正常組小鼠相比，隨DM病程的延長(zhǎng)，JNK2的表達(dá)上調(diào)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率相應(yīng)增加，推測(cè)JNK2可能參與了小鼠早期視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡過(guò)程，且有促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。

總之，盡管DR的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但JNK2作為參與凋亡的因素之一，對(duì)DM患者如阻斷JNK2途徑，就有可能控制或逆轉(zhuǎn)DR的發(fā)展，JNK2抑制劑的研究有可能成為DR治療的新途徑，但是隨著DR病程的進(jìn)展，JNK2的表達(dá)量是否會(huì)繼續(xù)上調(diào)，具體作用機(jī)制如何，對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用除了JNK2外是否還存在其他因子參與，JNK2與這些因子之間的關(guān)系等，仍有待于我們進(jìn)一步研究。

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