安氟醚和異氟醚預(yù)處理對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織Bcl－2／Bax mRNA和蛋白表達(dá)的影響

張愛國(guó) 余 凌 王雪琳

缺血再灌注損傷（Ischemia Reperfusion Injury，IRI）指缺血后再灌注不僅不能使組織器官功能恢復(fù)，反而加重組織器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷［1］。探討IRI的特點(diǎn)、規(guī)律和發(fā)生機(jī)制，已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)［2］。以異氟醚為代表的揮發(fā)性吸入麻醉劑對(duì)于許多器官的IRI具有細(xì)胞水平的多臟器保護(hù)效應(yīng)，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是IRI致肝細(xì)胞死亡的主要方式，而抑凋亡因子Bcl－2和促凋亡因子Bax的表達(dá)水平在其中發(fā)揮著重要作用。本研究以異氟醚和安氟醚兩種麻醉劑預(yù)處理小鼠，探討二者對(duì)其肝組織Bcl－2和Bax表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)藥物

健康雌性C57BL／6小鼠120只，鼠齡6～8周，體重20～25g，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分成安氟醚吸入干預(yù)組（E組）和異氟醚吸入干預(yù)組（I組）。安氟醚和異氟醚粉劑均購(gòu)于德國(guó)Sigma公司，實(shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水溶解，按Dahmani等［3］的方法配制成1.2%濃度霧化劑。

1.2 給藥方法

將E組和I組小鼠分別置于自制的有進(jìn)氣孔和出氣孔，容積大約2L的封閉艙內(nèi)，恒溫（36～38℃）、光照。實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)時(shí)E組用安氟醚霧化劑、I組用異氟醚霧化劑，使用霧化器分別向封閉艙內(nèi)灌注，氣流速度為5L／min。使用紅外線監(jiān)測(cè)儀（美國(guó)雷泰公司，型號(hào)：MX6）接出氣孔檢測(cè)藥物含量。采用經(jīng)小鼠耳緣靜脈監(jiān)測(cè)血氧飽和度（SpO2）和脈率（PR），使用自制面罩接紅外線監(jiān)測(cè)儀間斷監(jiān)測(cè)呼氣末二氧化碳（PETCO2）及呼吸頻率（RR），以確保其在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中處于正常生理水平。分別于麻醉前（T0）、麻醉即刻（T1）、麻醉2h（T2）、麻醉4h（T3）、麻醉6h（T4）和麻醉終止后2h（T5），取E組和I組各10只小鼠斷頸處死，并立即開腹取適量肝組織，置于液氮中保存，用于檢測(cè)Bcl－2和Bax mRNA表達(dá)，另取適量肝組織于4%福爾馬林溶液中固定，用以Bcl－2和Bax蛋白表達(dá)的檢測(cè)。

1.3 RT－PCR 檢測(cè)Bcl－2和Bax mRNA

取保存于液氮中肝組織，在液氮中研磨粉碎后，分別采用Trizol（MBI公司，芬蘭）提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（MBI公司，芬蘭）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后PCR擴(kuò)增小鼠肝組織中Bcl－2和Bax，以GAPDH為內(nèi)參照。Bcl－2引物：Forward Primer：5’－TGT TGG AGC CTA CCC CTC T－3’，Reverse Primer：5’－AAG AAG CAG CTT GAA GGA GC－3’；Bax引物：Forward Primer：5’－ACA CCT GAG CTG ACC TTG GA－3’，Reverse Primer：5’－ATG ATG GTT CTG ATC AGC TCG－3’；GAPDH 引物：Forward primer：5’－AAA TGA TAC CCC ACC GTG TGA－3’，Reverse primer：5’－TTG GTG GTG CAG GAT GCA TT－3’。以上引物均通過(guò)斯坦福大學(xué)網(wǎng)站引物在線設(shè)計(jì)，由上海博亞生物有限技術(shù)公司合成。反應(yīng)條件：94℃ 3min；94℃ 30s，57℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)，72℃6min。擴(kuò)增片段大小分別為576bp、287bp和526bp。PCR結(jié)束后，1.2%DNA凝膠電泳，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（Gel－Doc－It TS，美國(guó)）成像拍照，灰度掃描，采用Bcl－2或Bax電泳條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值定量分析Bcl－2和Bax表達(dá)量。

1.4 免疫組化法（SP法）測(cè)定Bcl－2和Bax蛋白含量

取適量經(jīng)福爾馬林溶液固定的肝組織，脫水后石蠟包埋，以4μm厚度連續(xù)切片制備白片，然后進(jìn)行免疫組化染色。兔抗鼠Bcl－2和Bax單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，PV－9000免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。免疫組化染色按照試劑盒說(shuō)明書操作。先對(duì)組織切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化，然后3%H2O2去離子水孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。EDTA（pH 8.0）修復(fù)液微波常規(guī)修復(fù)；待其自然冷卻后，PBS清洗1min，滴加100μl兔抗人BMI－1（1∶100稀釋），4℃孵育過(guò)夜后，PBS沖洗2min×3次；滴加試劑1，37℃孵育20min，PBS沖洗2min×3次，然后滴加試劑2，37℃孵育20～30min，PBS沖洗2min×3次。最后DAB顯色10min，終止顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇固定，封片并觀察。以PBS作陰性對(duì)照。采用Image－Pro Plus 5.0軟件（Media Cybernetics公司，美國(guó)）分析Bcl－2和Bax蛋白相對(duì)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織Bcl－2和Bax mRNA表達(dá)

經(jīng)異氟醚和安氟醚處理后，兩組小鼠肝組織中Bcl－2和Bax mRNA表達(dá)均上調(diào)，且隨麻醉時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增加，麻醉終止后2h表達(dá)均下調(diào)（圖1A）。定量分析結(jié)果顯示，相對(duì)于T0，T2～T5的Bcl－2和Bax mRNA表達(dá)均上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），以T4最為明顯（P＜0.01），而各組T1與T0比較Bcl－2mRNA表達(dá)有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1B）。

2.2 Bcl－2和Bax蛋白在兩組小鼠肝組織中的表達(dá)

圖1 兩組小鼠肝組織Bcl－2和Bax mRNA表達(dá)（n均＝10）

Bcl－2和Bax蛋白SP法陽(yáng)性染色均為棕黃色，可表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿和胞核中。兩組實(shí)驗(yàn)小鼠肝細(xì)胞在T0～T2時(shí)不著色或僅見少量胞漿呈陽(yáng)性染色，T3時(shí)兩組肝細(xì)胞胞漿均可見陽(yáng)性染色，胞核也呈陽(yáng)性染色；T4～T5時(shí)兩組肝細(xì)胞均見大量胞核染色陽(yáng)性。定量分析表明，兩組在T2～T5時(shí)肝組織Bcl－2蛋白含量較T0增加（P＜0.05或P＜0.01），而Bax蛋白含量在T3～T5時(shí)較T0時(shí)增加（P＜0.05或P＜0.01）。兩組Bcl－2和Bax蛋白在T1時(shí)表達(dá)均較T0時(shí)有所下調(diào)。與T0時(shí)比較，兩組Bcl－2／Bax蛋白比值均明顯升高（P＜0.05），以I組升高較為明顯。見表1。

表1 兩組小鼠肝組織中Bcl－2和Bax蛋白表達(dá)的變化（s，n均＝10）

表1 兩組小鼠肝組織中Bcl－2和Bax蛋白表達(dá)的變化（s，n均＝10）

注：與 T0比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

I組 0.318±0.014 0.324±0.016 0.486±0.0171） 0.426±0.032 0.516±0.0392） 0.432±0.0422）Bax E組 0.357±0.011 0.193±0.009 0.375±0.021 0.566±0.0632） 0.643±0.0512） 0.484±0.0372）I組 0.303±0.010 0.206±0.009 0.343±0.015 0.347±0.0121） 0.414±0.0321） 0.343±0.0211）Bcl－2／Bax E組 1.02±0.57 1.42±0.381） 1.16±0.241） 1.12±0.351） 1.06±0.37 1.08±0.13 I組 1.05±0.61 1.57±0.431） 1.42±0.311） 1.23±0.431） 1.26±0.431） 1.26±0.281）T0 T1 T2 T3 T4 T5 Bcl－2 E組 0.364±0.012 0.274±0.013 0.435±0.0121） 0.634±0.0432） 0.683±0.0642） 0.522±0.0342）蛋白 組別

3 討 論

越來(lái)越多的研究表明，以異氟醚為代表的揮發(fā)性吸入麻醉藥對(duì)機(jī)體具有不同程度的保護(hù)作用，其作用機(jī)制也已經(jīng)部分地揭示出來(lái)。Dahmani等［3］研究發(fā)現(xiàn)給予適量異氟醚，能導(dǎo)致大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化作用一過(guò)性和可逆性增強(qiáng)；脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)時(shí)，過(guò)剩的自由基可刺激SOD代償性升高，有效防護(hù)組織細(xì)胞損傷［4，5］。Bcl－2基因的表達(dá)主要位于線粒體、細(xì)胞核及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜上，能抑制線粒體通透性變化及線粒體凋亡誘導(dǎo)因子和細(xì)胞色素C的釋放，Bcl－2過(guò)表達(dá)時(shí)能完全抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，從而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用［6，7］。

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠吸入麻醉劑后的肝組織研究結(jié)果表明，安氟醚和異氟醚吸入2h后Bcl－2mRNA轉(zhuǎn)錄增加，6h后達(dá)高峰，麻醉終止后2h開始恢復(fù)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)隨著麻醉時(shí)間的延長(zhǎng)，促凋亡基因Bax mRNA表達(dá)也逐漸增加，進(jìn)一步在蛋白水平分析也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，因此推論，安氟醚和異氟醚對(duì)肝組織的保護(hù)可能主要通過(guò)上調(diào)Bcl－2表達(dá)發(fā)揮作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)兩組在T1時(shí)相肝組織Bcl－2表達(dá)降低，這種暫時(shí)性降低可能與麻醉早期的免疫抑制有關(guān)，也與Jang等［8］報(bào)道的安氟醚及異氟醚對(duì)T淋巴細(xì)胞的抑制是有選擇性的，而且是暫時(shí)的觀察結(jié)果相一致。Boost等［9］研究發(fā)現(xiàn)吸入不同麻醉劑對(duì)蛋白合成的影響不同，而本實(shí)驗(yàn)中T3～T5時(shí)相的E組Bcl－2和Bax蛋白表達(dá)高于I組Bcl－2和Bax蛋白表達(dá)的結(jié)果驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)。

綜上所述，吸入麻醉劑安氟醚、異氟醚可以使肝組織中Bcl－2和Bax mRNA表達(dá)和蛋白含量增加，其中又以異氟醚所致Bcl－2／Bax比值較高，即異氟醚可能通過(guò)抑制肝細(xì)胞凋亡而有益于肝組織自我保護(hù)功能。盡管其機(jī)制尚未完全清楚，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以為臨床麻醉劑的選擇應(yīng)用提供幫助。

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