高效液相色譜法測(cè)定18F－FDG 注射液中氨基聚醚含量

趙 巖，王曉靜，葉肇云，趙秀巖，姜 華

（原子高科股份有限公司，北京 102413）

氟［18F］脫氧葡萄糖（18F－FDG）注射液是目前應(yīng)用最廣泛的正電子發(fā)射斷層掃描（PET）顯像劑，主要用于惡性腫瘤的診斷和心肌及大腦葡萄糖代謝的測(cè)定。氨基聚醚（K2.2.2）是制備18FFDG 的重要試劑，由于具有較強(qiáng)的毒性，其含量是18FDG注射液質(zhì)量控制中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。國(guó)內(nèi)外有關(guān)K2.2.2含量測(cè)定方法較多，主要有薄層色譜法［1］、液相色譜法［2］、液質(zhì)聯(lián)用色譜法［3－4］、氣相色譜法［5］和紫外分光光度法［6］，其中，薄層色譜法為半定量法，不能準(zhǔn)確測(cè)定K2.2.2，液相色譜法、氣相色譜法和紫外分光光度法的檢測(cè)限均大于0.25mg／L，液質(zhì)聯(lián)用色譜法靈敏度最高，可以精確檢測(cè)到20μg／L，但因儀器昂貴不易推廣。目前，我國(guó)18FDG 注射液的生產(chǎn)中依照的標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒布的18F－FDG 注射液試行國(guó)標(biāo)，檢測(cè)限為K2.2.2低于25mg／L，檢測(cè)方法是由趙貴植等［6］建立的紫外分光光度法，利用K2.2.2在pH 6.4檸檬酸－氫氧化鈉緩沖溶液中與鉛（Ⅱ）形成的絡(luò)合物，在紫外波長(zhǎng)253nm 處進(jìn)行定量測(cè)定。該方法中本底溶液對(duì)結(jié)果有干擾，使測(cè)定值比實(shí)際值偏高，樣品用量較大，需使用0.5mL樣品完成一次測(cè)定。因此，亟需建立準(zhǔn)確度更高和樣品用量更少的檢測(cè)方法。

高效液相色譜法具有靈敏度高、樣品用量少，可分離混合物的優(yōu)點(diǎn)。因此，本工作擬在文獻(xiàn)［2］的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法對(duì)18FFDG 注射液中K2.2.2含量進(jìn)行測(cè)定，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，建立適用于本實(shí)驗(yàn)室的高效液相色譜測(cè)定方法。

1 主要試劑與儀器

1.1 主要試劑

K2.2.2對(duì)照品：純度＞99.0%，ABX 公司；脫氧葡萄糖（2－Deoxy－D－glucose），純度＞99.5%：Sigma公司。甲醇、乙腈：國(guó)產(chǎn)色譜純；磷酸三銨、乙酸銨：國(guó)產(chǎn)分析純

1.2 主要儀器

高效液相色譜（HPLC）儀：XTerraRP18 色譜柱（150mm×3.9mm，5μm），美國(guó)Waters公司；UV－2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：島津公司；AB135－S電子天平：瑞士Mettler公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HPLC流動(dòng)相的確定

分別采用50%乙腈、85%乙腈、V（50 mmol／L磷酸銨（pH9.3）∶V（乙腈）＝21∶4、V（50 mmol／L 磷酸銨（pH 8.3））∶V（乙腈）＝21∶4和V（50 mmol／L 乙酸銨）∶V（乙腈）＝1∶1等5 種不同組分的流動(dòng)相對(duì)100 mg／L K2.2.2和0.5g／L 脫氧葡萄糖進(jìn)樣分析。確定最佳流動(dòng)相。

2.2 HPLC流速的影響

采用V（50 mmol／L乙酸銨）∶V（乙腈）＝1∶1為流動(dòng)相，流速分別為0.5、1.0mL／min，測(cè)定18FDG注射液中K2.2.2的含量，確定最佳流速。

2.3 HPLC測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

采用V（50 mmol／L 乙酸銨）∶V（乙腈）＝1∶1為流動(dòng)相，流速0.5 mL／min，向高效液相色譜柱中加入10μL 100mg／L的K2.2.2溶液，分別于210、215、220nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 工作曲線

在優(yōu)化的色譜條件下，分別精密量取10μL，濃度為1、10、20、30、50mg／L 的K2.2.2注入液相色譜儀進(jìn)行分析。計(jì)算色譜峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，K2.2.2含量為橫坐標(biāo)，制做工作曲線。

2.5 精密度

將12.5mg／L K2.2.2和0.5g／L脫氧葡萄糖混合，為混合樣品1；將25mg／L K2.2.2和0.5g／L脫氧葡萄糖混合，為混合樣品2。在優(yōu)化的色譜條件下，分別將混合樣品1 和混合樣品2 在HPLC儀上連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)量K2.2.2含量。計(jì)算精密度。

2.6 回收率

在兩個(gè)混合樣品中分別加入0.495 mg 和0.972mg K2.2.2對(duì)照品，用HPLC測(cè)定樣品中K2.2.2的含量，計(jì)算回收率。

2.7 測(cè)定方法比較

對(duì)4批18F－FDG 注射液分別采用紫外分光光度法和HPLC法測(cè)定其K2.2.2含量，比較兩種方法的測(cè)定結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC流動(dòng)相的確定

對(duì)比5種流動(dòng)相下色譜柱上脫氧葡萄糖的保留和色譜圖上K2.2.2峰，可以看出，以V（50 mmol／L乙酸銨）∶V（乙腈）＝1∶1 為流動(dòng)相時(shí)，脫氧葡萄糖在色譜柱上無(wú)保留，并可檢出K2.2.2色譜峰，其余4種流動(dòng)相在本實(shí)驗(yàn)條件下未檢出K2.2.2色譜峰。因此，選擇V（50mmol／L乙酸銨）∶V（乙腈）＝1∶1為流動(dòng)相。

3.2 HPLC流速的影響

當(dāng)流速為1.0、0.5mL／min時(shí)，K2.2.2的 保留時(shí)間分別為1.66min和3.22min，因此，將流速確定為0.5mL／min。

3.3 HPLC測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

在吸收波長(zhǎng)210、215、220nm 處，K2.2.2吸收峰面積分別為706 707、401 264、147 987。可以看出，檢測(cè)波長(zhǎng) 為210nm 時(shí)，K2.2.2吸收峰 面積較大，此時(shí)方法的靈敏度較高。因此，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。

3.4 最佳條件下的色譜分析

選用V（50 mmol／L 乙酸銨）∶V（乙腈）＝1∶1為流動(dòng)相，流速為0.5 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，100 mg／L K2.2.2對(duì)照品和18F－FDG注射液的HPLC分離結(jié)果分別示于圖1和圖2。由圖1和圖2可見(jiàn)，K2.2.2對(duì)照品和18F－FDG 注射液中測(cè)定的K2.2.2保留時(shí)間基本一致，說(shuō)明檢測(cè)體系適應(yīng)性較好。

圖1 K2.2.2對(duì)照品的HPLC譜圖

3.5 工作曲線

在選定的HPLC條件下測(cè)定K2.2.2樣品，得到的工作曲線示于圖3。對(duì)圖3進(jìn)行線性擬合，線性回歸方程為y＝265 939.4x＋7 490.7，γ＝0.999。表明本分析方法在K2.2.21～50mg／L范圍內(nèi)線性良好。檢出限為0.5mg／L。

圖2 18F－FDG注射液中K2.2.2的HPLC譜圖

圖3 工作曲線

3.6 精密度

精密度結(jié)果列于表1。由表1可知，K2.2.2HPLC譜峰面積的精密度小于3.5%。說(shuō)明該方法精密度良好。

表1 精密度

3.7 回收率

當(dāng)混合樣品中定量加入K2.2.2對(duì)照品為0.495、0.972μg時(shí)，K2.2.2含量測(cè)定值分別為0.475、0.975μg，回收率分別為96.0%、100.3%，表明該方法回收率良好。

3.8 測(cè)定方法比較

分別采用紫外分光光度法和HPLC 法對(duì)4批18F－FDG 注射液中K2.2.2的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果列于表2。

紫外分光光度法測(cè)定K2.2.2時(shí)，由于有干擾物的影響，使測(cè)量結(jié)果偏高。

表2 兩種方法測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

采用HPLC法可以定量分析18F－FDG注射液中微量的K2.2.2，方法的線性范圍為1～50mg／L，γ＝0.999，檢出限為0.5 mg／L，回收率為96.0%～100.3%。本方法的干擾因素少，與紫外分光光度法相比更準(zhǔn)確、靈敏、用樣量少，適用 于18F－FDG注射液中微量K2.2.2含 量 的測(cè)定。

［1］Chaly T，Dahl JR.Thin layer chromatographic detection of Kryptofix 2.2.2in the routine synthesis of［18F］2－Fluoro－2－deoxy－D－glucose ［J］.Nucl Med Biol，1989，16：385－387.

［2］Nakao R，Ito T，Yamaguchi M，et al.Simultaneous analysis of FDG，ClDG and Kryptofix 2.2.2in［18F］FDG preparation by high－performance liquid chromatography with UV detection［J］.Nucl Med Biol，2008，35：239－244.

［3］Ma Y，Huang BX，Channing MA，et al.Quantification of Kryptofix 2.2.2in 2－［18F］FDG and other radiopharmaceuticals by LC／MS／MS ［J］.Nucl Med Biol，2002，29：125－129.

［4］張曉軍，李云剛，劉健，等.液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定常用18F藥物中Kryptofix 2.2.2的含量［J］.同位素，2011，24（3）：188－192.

［5］花寧，陳立光.氣相色譜法直接測(cè)量18F－FDG 中Kryptofix 2.2.2的含量［J］.同位素，2007，20（2）：105－107.

［6］趙貴植，龍衛(wèi)忠，李大康，等.分光光度法測(cè)定18FFDG 中的K2.2.2［R］.北京：原子能出版社，1997.