利用秀麗隱桿線蟲(chóng)初步評(píng)價(jià)藥物急性毒性

周雨朦，朱春寶，陳代杰，李繼安

(中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040)

秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans，C.elegans)是一種經(jīng)典的模式生物，因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、通體透明、繁殖快、生命周期短和易于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，被廣泛用于生命科學(xué)等領(lǐng)域。近年來(lái)，C.elegans又被用于藥物篩選研究和環(huán)境毒性檢測(cè)與生態(tài)毒理學(xué)研究。目前，已經(jīng)建立了 C.elegans高通量藥物篩選模型［1－3］和基于C.elegans的不同種類(lèi)化合物篩選方法(如抗感染藥物［4－6］、小分子鈣離子通道拮抗劑［7］和抗衰老藥物［1］。在環(huán)境毒性檢測(cè)中，已初步建立了 C.elegans液態(tài)環(huán)境研究方法［8－9］;利用C.elegans檢測(cè)環(huán)境中化學(xué)試劑、重金屬離子等毒性［10－11］。但是，利用 C.elegans對(duì)各類(lèi)藥物進(jìn)行毒性評(píng)估，還沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)道。因此，本研究采用C.elegans對(duì)4大類(lèi)抗感染抗生素，包括青霉素類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和3種抗腫瘤藥物進(jìn)行毒性評(píng)估，統(tǒng)計(jì)經(jīng)過(guò)待測(cè)藥物處理若干時(shí)間后線蟲(chóng)的存活率。這種存活率不僅反映待測(cè)藥物的綜合質(zhì)量，同時(shí)也反映了藥物隨時(shí)間在線蟲(chóng)體內(nèi)的積累效應(yīng)。通過(guò)了解不同種類(lèi)藥物對(duì)線蟲(chóng)的毒性，掌握化合物毒性范圍，為進(jìn)一步哺乳動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。初步建立非哺乳動(dòng)物——C.elegans藥物急性毒性評(píng)價(jià)體系。

1 材料與方法

1.1 藥物和儀器

青霉素(penicillin)、苯唑西林鈉(oxacillin sodium)、氨芐西林(ampicillin)、紅霉素(erythromycin)、阿奇霉素(azithromycin)、鹽酸四環(huán)素(tetracycline hydrochloride)、鹽酸金霉素(chlortetracycline hydrochloride)、土霉素 (oxytetracycline)、鏈霉素(streptomycin)、妥布霉素(tobramycin)、卡那霉素(kanamycin)、硫酸慶大霉素(gentamicin sulfate)、硫酸西索米星(sisomicin sulfate)、阿米卡星(amikacin)和絲裂霉素C(mitomycin C)由本實(shí)驗(yàn)室保藏，純度在99%以上。柔紅霉素(daunorubicin)和多柔比星(doxorubicin)購(gòu)自Pharmacia＆Upjohn公司。NV-T型體視顯微鏡(配視頻攝像器)為上海精密儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.2 秀麗隱桿線蟲(chóng)的培養(yǎng)

C.elegans WT Bristol N2［12］由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所惠贈(zèng)，glp-4(bn2ts);sek-1(km4)［6］由哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)部提供，均飼養(yǎng)于涂布E.coli OP50的標(biāo)準(zhǔn)線蟲(chóng)培養(yǎng)基(NGM)［13］中。E.coli OP50采用 Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 藥物毒性的測(cè)定

將處于產(chǎn)卵階段的線蟲(chóng)進(jìn)行同期化處理［17］，從平板上收集孕蟲(chóng)，清洗，最后剩約500μl蟲(chóng)懸液，之后加入400μl漂白劑(5%NaClO)和100μl NaOH 5 mol·L－1，漩渦振蕩3～4 min至蟲(chóng)體大部分溶解，然后加入無(wú)菌水稀釋?zhuān)?300×g離心1 min，棄上層液體，再清洗1次，收集同步化生長(zhǎng)的蟲(chóng)卵。將蟲(chóng)卵置于M9緩沖液［14］中15℃過(guò)夜孵育至 L1期。之后，將L1期線蟲(chóng)轉(zhuǎn)接到覆有E.coli OP50的NGM培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48～52 h到L4期(不孕階段)，用M9緩沖液將其從平板上洗下，重懸，清洗，收集蟲(chóng)體進(jìn)行藥物急性毒性實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)全部采用處于幼蟲(chóng)發(fā)育后期L4期的線蟲(chóng)進(jìn)行毒性考察實(shí)驗(yàn)。

配制不同濃度梯度的待檢測(cè)藥物溶液(表1)。將100μl配制好的待測(cè)藥物溶液加入無(wú)菌的96孔板中，然后再轉(zhuǎn)入100μl含20條的線蟲(chóng)溶液，最終毒性考察體系為200μl。每個(gè)藥物濃度梯度做3個(gè)復(fù)孔，以不含藥物的線蟲(chóng)溶液體系作為空白對(duì)照。在染毒后第1天，統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)存活率，之后每隔1 d，觀察線蟲(chóng)的存活情況，直到第7天。線蟲(chóng)身體僵直，用探針觸碰沒(méi)有反應(yīng)，判定為死亡。

Tab.1 Preparation of drugs

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，線蟲(chóng)生存統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5.01軟件。采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，log-rank檢驗(yàn)法對(duì)組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Origin Pro 8.0軟件處理分析，利用DoseResp函數(shù)進(jìn)行擬合，并計(jì)算藥物半致死劑量(LC50)，并且采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 不同品系線蟲(chóng)對(duì)藥物毒性的敏感度

實(shí)驗(yàn)考察野生型N2和突變型glp-4;sek-1線蟲(chóng)分別在含紅霉素250 mg·L－1、四環(huán)素或是多柔比星50 mg·L－1染毒體系中，7 d內(nèi)的存活情況。如圖1所示，在相同毒性體系中，glp-4;sek-1線蟲(chóng)的死亡速率要大于N2線蟲(chóng)的死亡速率。在紅霉素250 mg·L－1染毒體系中，N2線蟲(chóng)的半數(shù)死亡天數(shù)為5 d，glp-4;sek-1線蟲(chóng)的半數(shù)死亡天數(shù)為3 d(P＜0.01);在四環(huán)素 250 mg·L－1染毒體系中，N2 線蟲(chóng)的半數(shù)死亡天數(shù)為7 d、glp-4;sek-1線蟲(chóng)的半數(shù)死亡天數(shù)為 5 d(四環(huán)素 P＜0.01);在多柔比星50 mg·L－1染毒體系中，N2線蟲(chóng)的半數(shù)死亡天數(shù)＞7 d、glp-4;sek-1線蟲(chóng)的半數(shù)死亡天數(shù)為 3 d(P＜0.01)。結(jié)果表明兩種品系的線蟲(chóng)對(duì)藥物毒性的敏感度具有顯著性差異，glp-4;sek-1與N2線蟲(chóng)相比藥物的毒性更敏感。

Fig.1 Effect of EM，TC and Dox on N2 and glp-4;sek-1 survival rate.EM 250 mg·L －1;TC 250 mg·L －1;Dox 50 mg·L －1.

2.2 大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物毒性

考察紅霉素和阿奇霉素對(duì)線蟲(chóng)的急性毒性，選取染毒72 h后的數(shù)據(jù)進(jìn)行函數(shù)擬合(圖2)，相關(guān)系數(shù)R2均在0.99左右，表明存在典型的劑量-效應(yīng)關(guān)系。紅霉素對(duì)N2和glp-4;sek-1線蟲(chóng)的72 h半致死劑量〔LC50(72 h)〕分別 為 250 mg·L－1和120 mg·L－1;而阿奇霉素分別為 411 mg·L－1和286 mg·L－1。以上數(shù)據(jù)可以看出:① 在 N2和glp-4;sek-1線蟲(chóng)評(píng)估體系中，紅霉素的毒性均要大于阿奇霉素毒性(P＜0.05)。此結(jié)果與小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致(表2)。②glp-4;sek-1與N2線蟲(chóng)相比對(duì)紅霉素和阿奇霉素的藥物毒性更敏感。目前，glp-4;sek-1線蟲(chóng)已用于抗細(xì)菌和真菌感染藥物的高通量篩選［2－3］。作為常用的藥物篩選模型，并且具有對(duì)藥物毒性敏感度強(qiáng)的特性，因此，后續(xù)研究均采用glp-4;sek-1線蟲(chóng)考察藥物毒性。

Tab.2 Toxic index of testing drugs

Fig.2 Effect of EM and AZM on N2 and glp-4;Sek-1 survival rate.Data was fitted with DoseResp.

2.3 四環(huán)素類(lèi)藥物的毒性

采用上述方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和擬合(R2均在0.99左右)，四環(huán)素、土霉素和金霉素的LC50(72 h)分別為316，383和359 mg·L－1(圖3)。在線蟲(chóng)評(píng)估體系中，四環(huán)素、土霉素和金霉素的藥物毒性相當(dāng)，與資料顯示(表2)的小鼠口服急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

Fig.3 Concentration-response curve for the toxicity of TC，OTC and CTC.Data were fitted with DoseResp.

2.4 氨基糖苷類(lèi)藥物的毒性

對(duì)6種氨基糖苷類(lèi)藥物進(jìn)行線蟲(chóng)毒性考察，記錄染毒72 h后線蟲(chóng)存活數(shù)據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析擬合(圖4)。6種藥物對(duì)線蟲(chóng)的毒性大小為:妥布霉素＞慶大霉素＞西索米星＞鏈霉素＞卡那霉素＞阿米卡星;大致分為3個(gè)等級(jí):阿米卡星和卡那霉素LC50(72 h)＞2000 mg·L－1;鏈霉素、西索米星和慶大霉素LC50(72 h)在 1000 mg·L－1左右;妥布霉素LC50(72 h)＜500 mg·L－1。與資料報(bào)道的氨基糖苷類(lèi)藥物毒性作比較，發(fā)現(xiàn)在小鼠po和sc給藥急性毒性實(shí)驗(yàn)中，妥布霉素毒性(LD50分別為10 500和441 mg·kg－1)相對(duì)西索米星毒性(LD50分別為5000和288 mg·kg－1)較小，而在線蟲(chóng)體系中，妥布霉素的LC50(72 h)460 mg·L－1要大于西索米星的LC50(72 h)804 mg·L－1。表明某些藥物對(duì)線蟲(chóng)的毒性相對(duì)較強(qiáng)，而對(duì)小鼠的毒性相對(duì)較弱，而對(duì)于具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。但是總體上，線蟲(chóng)評(píng)價(jià)的藥物毒性大小基本與小鼠相似(圖5)。

Fig.4 Effect of AMK，Kan，SM，Siso，GM and Tob on glp-4;sek-1 survival rate.Data was fitted with DoseResp.AMK:amikacin;Kan:kanamycin;SM:streptomycin;Siso:sisomicin sulfate;GM:gentamicin sulfate;Tob:tobramycin.

Fig.5 Trend curve of aminoglycoside antibiotic toxicity on mice and glp-4;sek-1.

2.5 青霉素類(lèi)藥物的毒性

實(shí)驗(yàn)考察青霉素、氨芐西林和苯唑西林在62.5 ～2000 mg·L－1濃度范圍內(nèi)對(duì)線蟲(chóng)的毒性。實(shí)驗(yàn)采集了第5天的線蟲(chóng)存活數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)藥物濃度達(dá)到2000 mg·L－1時(shí)，所有染毒體系中線蟲(chóng)的存活率仍在95%以上(圖6)。根據(jù)化合物毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定，3種藥物對(duì)線蟲(chóng)幾乎沒(méi)有毒性，屬于低毒性化合物。

Fig.6 Effect of PV，Amp and OXSon glp-4;sek-1 survival rate.

2.6 抗腫瘤類(lèi)藥物的毒性

考察3種抗腫瘤類(lèi)藥物對(duì)線蟲(chóng)毒性分別為:柔紅霉素 LC50(72 h)為 45.5 mg·L－1;多柔比星 LC50(72 h)為55.8 mg·L－1;絲裂霉素 C LC50(72 h)為43.8 mg·L－1。柔紅霉素、多柔比星和絲裂霉素 C對(duì)線蟲(chóng)的毒性沒(méi)有顯著性差異(圖7)。與資料報(bào)道的小鼠評(píng)價(jià)體系相比，線蟲(chóng)體系對(duì)這3種抗腫瘤藥物沒(méi)有很高的毒性區(qū)分度，并且絲裂霉素C對(duì)線蟲(chóng)毒性和小鼠(LD50=23 mg·kg－1)相差不大。這3種抗腫瘤藥物的機(jī)制是抑制DNA生物合成，推測(cè)3種藥物對(duì)線蟲(chóng)造成的毒性是一致的，因此，在線蟲(chóng)評(píng)價(jià)體系中無(wú)法得到區(qū)分。

Fig.7 Effect of NDR，Dox and MMC on glp-4;sek-1 survival rate.Data was fitted with DoseResp.

3 討論

秀麗隱桿線蟲(chóng)已被廣泛用于各類(lèi)藥物篩選中，作為一個(gè)整體生物篩選模型對(duì)藥物的有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)。但是在對(duì)藥物進(jìn)行有效性評(píng)價(jià)的同時(shí)，是否可以對(duì)其安全性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用線蟲(chóng)在環(huán)境毒理學(xué)中研究的方法，對(duì)4大類(lèi)抗生素和3種抗腫瘤藥物進(jìn)行急性毒性評(píng)價(jià)，通過(guò)線蟲(chóng)存活率，來(lái)反映藥物的急性毒性。大部分藥物在線蟲(chóng)評(píng)價(jià)體系中呈現(xiàn)的毒性大小，與小鼠評(píng)價(jià)體系相類(lèi)似。然而，線蟲(chóng)作為黑箱式的評(píng)價(jià)系統(tǒng)，與哺乳動(dòng)物相比存在一些不足之處，包括線蟲(chóng)沒(méi)有心臟，呼吸系統(tǒng)，眼、耳和腎等器官，所以無(wú)法對(duì)藥物的具體毒性、損傷器官等進(jìn)行評(píng)價(jià)，可能造成對(duì)某些藥物毒性相對(duì)敏感或相對(duì)不敏感的差異。鑒于線蟲(chóng)與人類(lèi)種間距離太遠(yuǎn)，線蟲(chóng)的作用仍處在藥物研發(fā)和評(píng)價(jià)初期，為化合物快速粗篩和毒性評(píng)價(jià)提供線索。

總之，秀麗隱桿線蟲(chóng)是一個(gè)很好的藥物毒性檢測(cè)器，通過(guò)監(jiān)測(cè)線蟲(chóng)的死亡率來(lái)反映藥物急性毒性大小，對(duì)藥物的安全性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。與小鼠評(píng)價(jià)模型相比，此評(píng)價(jià)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單，監(jiān)測(cè)方便，周期短，投入少，更適合化合物高通量篩選和毒性預(yù)評(píng)估。

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