組織因子、組織因子途徑抑制物對膿毒癥凝血異常的影響

鄭少玲 郭振輝 孫 杰 姜 巧 陳 蕊

1.廣州醫(yī)學院，廣東廣州 510182；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院MICU，廣東廣州 510010

組織因子、組織因子途徑抑制物對膿毒癥凝血異常的影響

鄭少玲1郭振輝2孫 杰2姜 巧2陳 蕊2

1.廣州醫(yī)學院，廣東廣州 510182；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院MICU，廣東廣州 510010

目的 探討膿毒癥時組織因子（tissue factor，TF）與組織因子途徑抑制劑（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）的表達及其平衡對凝血異常的影響。 方法 昆明小鼠72只采用盲腸結(jié)扎穿孔模型 （cecal ligation and puncture，CLP），分為正常組、假手術(shù)組和造模組，每組根據(jù)不同時間點（2、4、8、12 h）分4個亞組，每個亞組各6只，檢測血小板計數(shù)和凝血指標，采用ELISA法檢測血漿TF和TFPI濃度。 結(jié)果 盲腸結(jié)扎穿孔后，造模12 h組PT、TT、APTT和DD顯著升高，F(xiàn)bg和PLT計數(shù)顯著降低，與正常組及假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。造模2 h組TF與TFPI均顯著升高，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；且TF濃度隨時間呈進行性升高，而TFPI未見進一步升高。結(jié)論 膿毒癥時，血小板減少及TF、TFPI表達增加的失衡可能是誘發(fā)凝血異常進而參與MODS發(fā)生的關(guān)鍵因素。

膿毒癥；凝血異常；血小板減少；組織因子；組織因子途徑抑制物

膿毒癥常常伴有凝血功能異常，內(nèi)皮細胞的激活和功能紊亂在其中起了關(guān)鍵作用，內(nèi)皮組織一方面通過組織因子（tissue factor，TF）的表達 、凝血 因子 （von Willebrand factor，vWF）和血小板之間的相互作用達到促凝血效應(yīng)，另一方面，通過抑制抗凝劑組織因子途徑抑制劑 （tissue factor pathway inhibitor，TFPI）的反應(yīng)、抗凝血酶和活化蛋白C系統(tǒng)，抑制纖維蛋白原溶解[1-2]。過激的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致大量微血管血栓形成和器官功能衰竭（MODS），成為彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）的病理生理過程[3-4]。TFPI是TF的重要生理抑制物，存在于微血管內(nèi)皮細胞里，拮抗TF的凝血啟動，在抑制血栓形成和血管重塑等方面發(fā)揮重要作用，還與炎癥、動脈粥樣硬化 （AS）、腫瘤、敗血癥等疾病相關(guān)[5]。TF與TFPI的平衡影響著DIC和MODS的發(fā)生，而游離的TF、TFPI在一定程度上反映其表達水平。為此，本實驗擬采用經(jīng)典膿毒癥模型——盲腸結(jié)扎穿孔（CLP），復(fù)制小鼠膿毒癥模型，觀察血小板計數(shù)、凝血指標和游離TF、TFPI水平的變化，探討膿毒癥時TF與TFPI的表達，及其平衡對凝血異常的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：高速低溫離心機（Sigma），酶標儀（Anto），ZK-82A電熱真空干燥箱（上海實驗儀器總廠），血細胞分析儀（sysmex XT-1800I），凝血分析儀（STA compact CT）。試劑：Mouse TF 96 test ELISA Kit （美國 R&D公司），Mouse TFPI 96 test ELISA Kit（美國R&D公司）。

1.2 動物分組及造模

健康雌性昆明小鼠72只，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，體重（22±4）g，適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周，術(shù)前禁食禁水 12 h，隨機分為正常組、假手術(shù)組、造模組，每組各24只；各組按術(shù)后時間點又分為2、4、8、12 h四個亞組，每亞組各6只。正常組不做任何處理。造模組采用經(jīng)典CLP模型：用10%水合氯醛（0.03mL/10 g）經(jīng)腹腔注射麻醉小鼠，沿腹正中線作1 cm切口，找到盲腸，結(jié)扎盲腸根部，用大號針頭在盲腸遠端刺一孔，擠出少量腸內(nèi)容物，還納腹腔，逐層縫合腹壁。假手術(shù)組開腹找到盲腸后，隨即關(guān)腹。造模組和假手術(shù)組給予注射生理鹽水（約 0.2mL/6 h）。

1.3 實驗方法

1.3.1 TF、TFPI濃度測定 采用ELISA法。各組按時間點經(jīng)眼眶采血，收集血液標本至無菌無致熱源1.5 mL EP管中，4℃靜置過夜，將血樣高速離心2 000 g 15min后取上清，分裝后-70℃保存。實驗前，室溫下溶解標本，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，繪制標準曲線，計算樣本TF、TFPI濃度。

1.3.2 血小板與凝血四項檢查 取各組術(shù)后12 h亞組的血樣0.5mL置于0.109mol/L枸櫞酸鈉抗凝試管中，檢測血小板計數(shù)（PLT）。同法取血樣0.5mL高速離心2 000 g 10min，取上清液，以磁珠法進行凝血四項分析，檢測凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）、活化部分凝血酶時間（APTT），纖維蛋白原（Fbg），以酶聯(lián)免疫熒光定量法測定D-二聚體（DD）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組術(shù)后12 h亞組的凝血指標比較

與正常組和假手術(shù)組相比，造模組術(shù)后12 h凝血指標中的PT、TT、APTT和DD顯著升高；而Fbg和PLT計數(shù)顯著降低，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組術(shù)后不同時間TF濃度比較

繪制TF濃度標準曲線：Y=114.5X-2.936（R2=0.994）。造模組各時間TF濃度均顯著高于正常組和假手術(shù)組，且隨著時間的增加呈現(xiàn)顯著的上升趨勢；與正常組相比，假手術(shù)組TF濃度也顯著升高；各組間比較差異有統(tǒng)計學意義 （P<0.05）。 見表 2。

2.3 各組術(shù)后不同時間TFPI濃度比較

對標準品進行梯度稀釋得出TFPI標準曲線為Y=9.73X-0.014（R2=0.994），樣品以 1∶3 稀釋，故樣本 TFPI的實際濃度為測得數(shù)據(jù)的4倍。與正常組及假手術(shù)組相比，造模組各時間點TFPI濃度均明顯上升，假手術(shù)組與正常組相比TFPI濃度亦顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但術(shù)后4 h之后造模組TFPI濃度并沒有隨時間的延長而呈現(xiàn)上升趨勢。見表3。

3 討論

各種原因?qū)е碌母鼓ぱ资悄摱景Y常見病因之一，CLP模型有效地模擬了腹腔空腔臟器穿孔與感染，并產(chǎn)生膿毒癥甚至MODS，而凝血功能相關(guān)指標的異常與膿毒癥進展程度顯著相關(guān)[6]。本實驗結(jié)果顯示，造模組術(shù)后12 h的PLT和Fbg均明顯下降，同時，PT、TT、APTT 和 DD 升高（P<0.05）。說明膿毒癥發(fā)生的早期，凝血因子大量消耗，同時，被激活的纖溶激酶降解，凝血亢進與纖溶失衡是膿毒癥發(fā)生發(fā)展至DIC的主要病理生理過程。在炎癥刺激后，血小板被激活，在血小板表面大量促凝物質(zhì)表達，膜表面為各種凝血蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的成分提供了凝集的必要條件，特別是磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS），是重要的凝血級聯(lián)反應(yīng)的細胞催化劑。血小板的凋亡與消耗增加，導(dǎo)致血小板減少。在膿毒癥過程中，血小板減少癥頻繁發(fā)生，成為膿毒癥患者死亡的獨立危險因素，血小板也成為重要的標志物[7-8]。

表1 各組術(shù)后12 h亞組的血小板、凝血四項和D-二聚體比較（，n=6）

表1 各組術(shù)后12 h亞組的血小板、凝血四項和D-二聚體比較（，n=6）

注：與正常組比較，★P<0.05；與假手術(shù)組比較，☆P<0.05

組別 PLT（×109/L） PT（s） TT（s） APTT（s） Fbg（g/L） DD（mg/L）正常組假手術(shù)組造模組181.33±35.10 172.83±24.23 122.33±55.50★☆11.67±2.16 12.33±1.63 17.00±2.28★☆15.17±2.64 16.33±2.16 19.00±2.61★☆27.50±4.04 27.67±1.97 38.50±4.51★☆3.07±0.64 3.57±0.61 1.85±0.30★☆0.42±0.26 0.55±0.27 1.90±0.45★☆

表2 各組術(shù)后不同時間小鼠血標本TF濃度比較（，n=6，pg/m L）

表2 各組術(shù)后不同時間小鼠血標本TF濃度比較（，n=6，pg/m L）

注：與正常組比較，★P<0.05；與假手術(shù)組比較，☆P<0.05

組別 2 h 4 h 8 h 12 h正常組假手術(shù)組造模組42.44±2.19 54.12±3.47★59.81±3.69★☆42.29±1.98 53.70±4.14★82.77±9.11★☆41.45±1.32 56.33±2.68★125.34±6.32★☆42.75±1.25 60.73±1.43★139.81±6.17★☆

表3 各組術(shù)后不同時間小鼠血標本TFPI濃度比較（，n=6，ng/m L）

表3 各組術(shù)后不同時間小鼠血標本TFPI濃度比較（，n=6，ng/m L）

注：與正常組比較，★P<0.05；與假手術(shù)組比較，☆P<0.05

組別 2 h 4 h 8 h 12 h正常組假手術(shù)組造模組14.60±0.76 16.67±2.19★26.20±2.21★☆15.11±0.37 18.94±0.39★28.08±2.46★☆15.72±0.92 18.01±2.92★27.45±2.52★☆15.00±0.42 19.1±0.96★29.2±1.41★☆

膿毒癥時凝血異常與炎癥反應(yīng)之間相互影響，形成惡性循環(huán)，在連結(jié)凝血和炎癥過程中，TF最為關(guān)鍵，是啟動外源性凝血途徑的關(guān)鍵凝血因子[9]。本實驗測得游離TF水平，造模組各時間點均高于正常組、假手術(shù)組，并隨時間延長而升高。TF通常不存在與脈管系統(tǒng)，但在炎癥狀態(tài)下，通過炎癥因子的激活，誘導(dǎo)了單核細胞和巨噬細胞表達TF，并啟動凝血過程[10-11]。目前認為，循環(huán)中的TF已經(jīng)被看作血細胞的成份之一，尤其是血細胞微粒相關(guān)的TF，以可溶解的形式在血液中流通，并完成促凝血活動，進一步擴大了循環(huán)TF的概念。內(nèi)皮細胞在促炎細胞因子的刺激下釋放TF，循環(huán)TF的血漿濃度可作為炎癥誘導(dǎo)凝血激活的臨床標志物之一[4]。

在生理條件下，抗凝系統(tǒng)是持續(xù)活動的，以防止血液在內(nèi)皮細胞表面形成凝塊。在維護這個抗凝環(huán)境中，內(nèi)皮組織起了關(guān)鍵作用，通過3個主要的抗凝蛋白來控制血凝塊：TFPI、AT和APC[12]。TFPI是目前所知的唯一能抑制Ⅶa/TF復(fù)合物活性的生理性抗凝物質(zhì)，其能夠抑制構(gòu)建在磷脂小體上的Ⅶa/TF復(fù)合物的活性。TFPI表達影響凝血功能及其病理狀態(tài)下的DIC發(fā)生[13]。TF一旦啟動凝血途徑，血管內(nèi)皮細胞（VEC）上的TFPI將迅速改變構(gòu)型，與TF介導(dǎo)的凝血因子復(fù)合物結(jié)合形成失活的FⅩa-TFPI-FVⅡa-TF而發(fā)揮其抗凝功能[14]。游離的TFPI可能反映VEC的持續(xù)損傷，導(dǎo)致錨著于其上的高活性TFPI脫落。因此，同時檢測游離的TF和TFPI水平，既可反映各自表達的動態(tài)變化，也能反映凝血功能的異常[15]。本實驗結(jié)果顯示：造模組術(shù)后2 h，TF濃度和TFPI濃度顯著升高，其后，TF的表達呈進行性上升，而TFPI并沒有進一步升高。說明膿毒癥早期各種效應(yīng)細胞表達并產(chǎn)生了大量的游離TF，啟動并激活凝血系統(tǒng)，而后TF與TFPI的不同步升高，表明了膿毒癥時存在凝血激活持續(xù)亢進狀態(tài)，而抗凝的物質(zhì)在質(zhì)和量上出現(xiàn)了相對的不足。TFPI是正常附屬于內(nèi)皮渠道的蛋白聚糖 （PGs），PGs是黏多糖GAGs綁定的一個核心蛋白，在膿毒癥中，促炎細胞因子減少在內(nèi)皮表面的GAGs合成體，可以因此影響TFPI的功能，這也影響了凝血激活和抗凝過程的平衡，導(dǎo)致了凝血的激活與亢進[16]。

綜上所述，膿毒癥時存在血小板減少和凝血異常，在凝血激活與亢進的同時，TF、TFPI表達出現(xiàn)不同步增加。由此推測，TF、TFPI表達增加的失衡可能是誘發(fā)凝血異常進而參與MODS發(fā)生的關(guān)鍵因素。

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Effects of tissue factor and tissue factor pathway inhibitor on sepsis-induced abnormal coagulation

ZHENG Shaoling GUO Zhenhui SUN Jie JIANGQiao CHEN Rui
1.Guangzhou Medical University,Guangdong Province,Guangzhou 510182,China;2.Department of MICU,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command,Guangdong Province,Guangzhou 510010,China

Objective To investigate the effects of tissue factor(TF)and tissue factor pathway inhibitor(TFPI)expression and balance on abnormal coagulation in sepsis.Methods72 KM mice were performed cecal ligation and puncture(CLP),and divided into the normal group,sham-operated group and model group.According to the different time points(2,4,8,12 h),the three group were divided into 4 subgroups respectively,each group had 6mice.The level of platelet and coagulationmarkerswere observed,and the blood concentration of TF and TFPIwas detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsCompared with normal group and sham-operated group,the concentration of PT,TT,APTT and DD increased significantly,while Fbg and PLT decreased in themodel group at 12 h after CLP (P<0.05).The concentration of TF and TFPI increased significantly in themodel group at 2 h after CLP,each group had significant differences(P<0.05).With time extension,the concentration of TF continually increased,but the concentration of TFPI showed inversely.ConclusionIn sepsis,thrombocytopenia and imbalance of TF and TFPI expression may be key factors induced abnormal coagulation and MODS.

Sepsis;Abnormal coagulation;Thrombocytopenia;Tissue factor;Tissue factor pathway inhibitor

R656

A

1673-7210（2012）12（a）-0013-0312222

解放軍總后勤部十二五重點專項計劃（項目編號：衛(wèi)保健2010119號-10djz09）。

鄭少玲（1981.11-），女，主治醫(yī)師，2007級廣州醫(yī)學院急診醫(yī)學專業(yè)在讀碩士；研究方向：重癥膿毒癥凝血功能障礙的臨床研究。

郭振輝，男，博士研究生，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師；研究方向：重癥膿毒癥凝血功能障礙的臨床研究。

2012-09-24 本文編輯：程 銘）