雞傳染性貧血病毒VP1基因的原核表達(dá)

馮 昕，榮 俊 (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

匡紅艷 (長江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434000)

雞傳染性貧血病毒VP1基因的原核表達(dá)

馮 昕，榮 俊 (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

匡紅艷 (長江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434000)

根據(jù)GenBank上公布的雞傳染性貧血病毒VP1的基因序列設(shè)計(jì)一系列引物,通過基因擴(kuò)增得到了雞傳染性貧血病毒(CAV)VP1基因的全長片段和一系列不同N末端截?cái)嗟腣P1基因片段，分別將這些片段插入表達(dá)質(zhì)粒載體pET28a的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建成4種重組表達(dá)工程菌(E.coliBL21/pET-28-CAVVP1、E.coliBL21/pET-28-CAVVP1Nd29、E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd56、E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd137)，研究了4種不同長度VP1片段在重組大腸桿菌中的表達(dá)， 并通過SDS-PAGE電泳篩選最佳表達(dá)方式。結(jié)果表明：E.coliBL21/pET-28-CAVVP1Nd29能表達(dá)分子質(zhì)量為44ku的可溶性蛋白，E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd56能表達(dá)分子質(zhì)量為40ku的不可溶性蛋白，而在E.coliBL21/pET-28-CAV VP1 和E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd137的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物中未見明顯的表達(dá)蛋白出現(xiàn)。其中可溶性的CAV VP1Nd29蛋白將有可能用于研制CAV診斷抗原和亞單位疫苗研究。

雞傳染性貧血；抗原蛋白；原核表達(dá)

雞傳染性貧血病毒(Chicken anemia virus，CAV)是雞傳染性貧血病(Chicken infectious anemia，CIA)的主要病原，主要侵害雛雞，造成以雞群死亡率升高、再生障礙性貧血、骨髓黃化、胸腺等淋巴器官萎縮為特征的免疫抑制性傳染病[1-2]。CAV 在雞群中廣泛存在,可水平傳播和垂直傳播。成雞感染 CAV 后呈亞臨床帶毒狀態(tài),易被忽視,是養(yǎng)雞業(yè)上潛藏的巨大威脅。自1979年在日本首次分離到CAV[3]以來，包括我國在內(nèi)的許多國家[4-5]都相繼證明了該病毒的存在。目前，CAV在世界范圍內(nèi)已呈蔓延趨勢，成為危害家禽業(yè)的主要病原體之一，已引起世界各國禽業(yè)的廣泛關(guān)注。

CAV屬圓環(huán)病毒科環(huán)狀病毒屬，是已知的最小病毒之一，全基因組大小為2319bp，包括3個部分或完全重疊的開放閱讀框(ORF)，大小分別為1347、648 和363 個核苷酸殘基,其中648nt的ORF完全重疊,與1347nt 的ORF部分重疊[6]。3個ORF分別編碼52ku的衣殼蛋白VP1；24ku的分子伴侶VP2；14ku的細(xì)胞凋亡素VP3。VP1為CAV唯一的衣殼蛋白和主要免疫原蛋白，VP2為非結(jié)構(gòu)蛋白，VP3為病毒的致病性蛋白，以凋亡的方式引起感染細(xì)胞的死亡[7]。Noteborn等[8]在昆蟲細(xì)胞中分別表達(dá)VP1、VP2或共表達(dá)VP1和VP2蛋白，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)表達(dá)VP1或VP2均不能刺激雞產(chǎn)生CAV特異性抗體，而VP1和VP2共同表達(dá)產(chǎn)物則可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。這表明被表達(dá)的重組VP1、VP2蛋白可以被用作一種亞單位疫苗。

為研究適用于亞單位疫苗用的CAV 原核表達(dá)抗原蛋白，本研究對CAV VP1的N端基因序列進(jìn)行不同程度的剪切，并與pET-28a載體連接，構(gòu)建成VP1基因的不同表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)不同長度CAV VP1片段的的表達(dá)，并比較不同VP1基因片段表達(dá)產(chǎn)物的差異，篩選出合適的蛋白表達(dá)方式，為VP1病毒的檢測用抗原蛋白和亞單位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 CAV毒株與菌株

CAV毒株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，大腸桿菌DH5α、BL21購自全式金生物技術(shù)有限公司，pMD-18T載體購自大連寶生物公司,EcoRⅠ、XhoⅠ購自大連寶生物公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Hiremath等在GenBank公布的VP1序列設(shè)計(jì)引物。引物序列詳見表1。其中5’-端有下劃線的部分是附加的酶切位點(diǎn)，上游引物為EcoRⅠ，下游引物為XhoⅠ。所有引物由三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司合成。

表1 CAV VP1基因N端剪切系列引物序列

1.3 VP1基因的PCR擴(kuò)增

以CAV種毒培養(yǎng)液為模板，使用上述引物擴(kuò)增VP1全序列以及VP1Nd29、 VP1Nd56、VP1Nd137片段。反應(yīng)體系為毎管10倍PCR buffer 2μl，dNTP 0.2μl，上下游引物各1μl，模板2μl，Taq酶0.2μl，用ddH2O補(bǔ)體積至20μl。熱循環(huán)參數(shù)為：94℃ 5min；94℃ 30s，64℃ 30s，72℃ 1min30s，35個循環(huán)；72℃ 10min，4℃ 2min終止。取PCR產(chǎn)物10μl瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆載體構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外燈下切下目的條帶，用DNA片段凝膠回收試劑盒純化目的片段。純化后的目的片段同pMD18-T載體連接，連接體系：5倍連接酶buffer 2μl，PCR回收產(chǎn)物6.5μl，pMD-18T載體0.5μl，連接酶1μl，16℃連接過夜。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，涂布于加有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單個菌落接入含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，取菌液以上述體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，選取結(jié)果為陽性轉(zhuǎn)化菌的提取質(zhì)粒，分別命名為：pMD-CAV VP1、pMD-CAV VP1Nd29、pMD-CAV VP1Nd56和pMD-CAV VP1Nd137。

1.5 表達(dá)載體的構(gòu)建

將回收質(zhì)粒的pMD-CAV VP1、pMD-CAV VP1Nd29、pMD-CAV VP1Nd56和pMD-CAV VP1Nd137，連同表達(dá)質(zhì)粒載體pET-28a分別用EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切。目的片段用瓊脂糖凝膠電泳回收，使用T4連接酶連接目的片段與線性化的質(zhì)粒載體pET-28a，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，涂布于含卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)。挑取單個菌落按1.3所述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，陽性的即為重組表達(dá)質(zhì)粒。分別命名為：pET-28-CAV VP1、pET-28-CAV VP1Nd29、pET-28-CAV VP1Nd56和pET-28-CAV VP1Nd137。

1.6 目的基因的表達(dá)

將上述重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞。其轉(zhuǎn)化菌分別命名為：E.coliBL21/pET-28-CAV VP1，E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd29、E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd56和E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd137。分別挑取單菌落接入含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。按1∶100接菌到含卡那霉素的30ml的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至光密度值達(dá)到0.6時，加入濃度為0.2mol/L的乳糖3ml，分別在25℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜[9]，和37℃中誘導(dǎo)5h后收集菌體，用0.02mol/L pH7.4的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液懸浮菌體并用超聲波破碎，分別收集破碎后的上清液和沉淀。

1.7 表達(dá)蛋白的分析

將收集到的上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測重組表達(dá)蛋白的情況并比較全序列與幾種不同剪切方式表達(dá)蛋白可溶性的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 CAV VP1基因片段的擴(kuò)增

M:DNA Marker;1：空白對照；2：CAV VP1全基因；3：CAV VP1Nd137;4：CAV VP1Nd56；5：CAV VP1Nd29;6：CAV VP1全基因

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)在1350、1263、 1182、939bp處有DNA擴(kuò)增帶(圖1)，大小與預(yù)期相同。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：空白表達(dá)菌全菌對照；2：E.coli BL21/pET-28-CAV VP1全菌；3：E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd29全菌；4：E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56全菌；5～6：E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd137全菌；7：E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd29上清

2.2 VP1重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

對重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28-CAV VP1、pET-28-CAV VP1Nd29、pET-28-CAV VP1Nd56和pET-28-CAV VP1Nd137進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果與圖1一致，表明目的片段已經(jīng)成功克隆到了表達(dá)載體上。

2.3 重組表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)

將含有各組表達(dá)載體的陽性菌經(jīng)乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd29、E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd56經(jīng)誘導(dǎo)后有明顯表達(dá)帶出現(xiàn)，前者分子質(zhì)量在44ku附近，后者分子質(zhì)量在40ku附近。而E.coliBL21/pET-28-CAV VP1和E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd137無明顯表達(dá)(圖2)。

2.4 表達(dá)蛋白的溶解特性

將表達(dá)菌超聲波裂解后，分別取上清液和沉淀進(jìn)行電泳，發(fā)現(xiàn)E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd29表達(dá)片段在上清液中非常明顯，E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd56重組蛋白絕大部分以沉淀形式存在，上清中含量很少(圖3、圖4)。

3 討論

本研究嘗試將VP1片段以正確的方式插入pET-28a載體中，構(gòu)建的表達(dá)菌E.coliBL21/pET-28-CAV VP1未能獲得明顯的表達(dá)。而將VP1片段進(jìn)行不同方式的裁剪后構(gòu)建的E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd29和E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd56經(jīng)誘導(dǎo)后有明顯表達(dá)帶出現(xiàn)，E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd137無明顯表達(dá)。在2個能有明顯表達(dá)的工程菌中E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd29的表達(dá)產(chǎn)物至少有半數(shù)是可溶的蛋白質(zhì)，而E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd56的表達(dá)產(chǎn)物幾乎全不可溶。

目前國內(nèi)尚無標(biāo)準(zhǔn)的CAV ELISA診斷試劑盒，給CAV引起的疾病的調(diào)查和診斷帶來諸多不便。與全毒抗原相比，原核表達(dá)的重組蛋白作為抗原可以克服CAV在體外培養(yǎng)效率低，難以獲得大量診斷用抗原的缺點(diǎn)，而且重組抗原成分相對單一，免疫反應(yīng)的特異性會更強(qiáng)。另一方面,目前對于CAV的防治尚無理想的疫苗，國內(nèi)外研制出的活疫苗和滅活疫苗雖已用于免疫接種，但均存在病毒體外培養(yǎng)困難和價格高昂的缺陷[10]。目前尚未分離到非致病性的毒株，因此所用的活疫苗株都為弱致病性的毒株，免疫后持續(xù)感染，蛋源傳播和毒力增強(qiáng)的風(fēng)險都很大。本研究探討了利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CAV抗原蛋白的方法，以E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd29表達(dá)菌最優(yōu)，實(shí)現(xiàn)了體外大量表達(dá)，且有相當(dāng)部分可溶。這為進(jìn)一步研究CAV的致病機(jī)制和研制CAV重組診斷抗原、亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:空白表達(dá)菌上清對照;2:E. coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd29 表達(dá)上清; 3:E. coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56 表達(dá)上清; 4 ～ 5: E. coli BL21/pET-28-CAVVP1Nd137 表達(dá)上清; 6: E.coli BL21/pET-28-CAV VP1 表達(dá)上清

M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1: 空白表達(dá)菌沉淀對照; 2:E. coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd29 表達(dá)沉淀部分; 3:E. coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56 表達(dá)沉淀部分; 4 ～5:E. coli BL21/pET-28-CAVVP1Nd137 表達(dá)沉淀部分; 6: E. coli BL21/pET-28-CAV VP1 表達(dá)沉淀部分

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10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.03.010

Q786

A

1673-1409(2012)03-S034-04

2012-03-10

馮 昕(1987-)，男，湖北荊州人，碩士生，現(xiàn)從事基因工程疫苗研究。

榮 俊，E-mailrongjun59626@gmail.com。