治療骨質(zhì)增生疼痛中藥酒的指紋圖譜研究

段梅莉* 石 慧 吳海波 李 卉 黃麗瑛 李建其*

（1 華東理工大學(xué)，上海 200237；2 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200437）

骨質(zhì)增生引起的肩周炎等各種疼痛是中老年常見疑難病癥，尚無特效的西藥醫(yī)治，臨床常用的鎮(zhèn)痛藥有對乙酰氨基酚（撲熱息痛）、非甾體抗炎藥等緩解鎮(zhèn)痛病情的藥物[1]。雖有針灸、按摩牽引等療法，但存在復(fù)發(fā)率高的缺點[2,3]。由于中藥治療效果較好，近年來以中藥治療骨質(zhì)增生疼痛漸成主流[4-6]。

本文中治療骨質(zhì)增生疼痛的中藥方劑是以藥酒形式給藥[7]。該藥酒飲用量低（1～5mL/次），起效快，藥效高且持久。我們以藥酒為原料，濃縮后用溶劑萃取法分離其組成，對得到的各分離相進行鎮(zhèn)痛活性測試，并用HPLC、NMR圖譜對有較好活性的水相AD進行鑒定分析。并且將相同中藥方劑的水提藥液濃縮，測試用溶劑萃取法得到的水相WP，通過該方劑藥酒和水提藥液鎮(zhèn)痛活性的比較，分析評價了它們之間的區(qū)別。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

將中藥紅花、紫草、草烏、川烏、烏蛇、烏梅及雙花按照一定配比用高度白酒浸制而成藥酒；按照相同中藥配方，用水煎煮而成水提藥液；AR級無水乙醚，石英砂，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇，上海振興化工一廠；CP級正丁醇，上海菲達工貿(mào)公司。

1.2 分析方法和儀器

美國Waters 2795高效液相色譜儀，HPLC色譜柱為Xterra-C18（2.1×150mm，5μm），流動相為0.05%TFA水溶液/0.05%TFA的乙腈溶液，樣品流速為0.2mL/min，柱溫30℃，檢測光波長247nm。德國BRUKER AVANCE 500超導(dǎo)傅立葉變換核磁共振波譜儀，NMR樣品制備以D2O為溶劑。鎮(zhèn)痛活性采用醋酸扭體法和熱板法進行測試。

2 實驗結(jié)果和討論

2.1 藥酒的濃縮分離

用白酒浸制的方劑藥液呈紫紅色透明狀液體。將500mL藥酒濃縮后得到6.0g的褐色黏稠膏狀物，加入200mL的蒸餾水?dāng)嚢?，按由低到高的極性順序用有機溶劑乙醚、氯仿和正丁醇逐級進行萃取。各萃取相濃縮后的質(zhì)量及其含量百分比見表1，可明顯看出水相AD是藥酒中含量最高的一個組分，占總量的70%～80%。

表1 藥酒的溶劑萃取相含量百分比

2.2 藥酒分離相的鎮(zhèn)痛活性評價

藥酒經(jīng)溶劑萃取得到的乙醚相、氯仿相以及正丁醇相均難溶于水，采用灌胃給藥的方式進行試驗，水相采用皮下給藥的方式對小老鼠進行了鎮(zhèn)痛活性試驗，具體數(shù)據(jù)見表2、表3。結(jié)果顯示，氯仿相和正丁醇相均無鎮(zhèn)痛活性；乙醚相有鎮(zhèn)痛作用，但兼具致痛作用；藥酒中水相AD由表1可知是各萃取相中含量最多的組分，而且AD易溶于水，采用皮下給藥的方式對小老鼠進行的鎮(zhèn)痛活性試驗結(jié)果顯示，AD在所測劑量范圍和給藥方式下對扭體法和熱板法的實驗都有效，具有較好的鎮(zhèn)痛作用。因此，水相AD指紋圖譜的確定應(yīng)是藥酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的重點。

表2 扭體法測定各萃取相鎮(zhèn)痛活性的結(jié)果

表3 熱板法測定各萃取相鎮(zhèn)痛活性的結(jié)果

2.3 藥酒水相AD的HPLC分析

HPLC指紋圖譜分析選用Xterra-C18色譜柱，適用于強極性物質(zhì)的分離。為保證溶液的均一性，對每個樣品采取了兩次進針的原則，得到的HPLC譜圖見圖1。浸制1個月和3個月的藥酒中水相樣品進針后2～6min，10～12min，13～18min以及24min的出峰有4組，這些曲線基本保持一致，重復(fù)率高，穩(wěn)定性好。這些結(jié)果表明，HPLC的測定方法可以作為治療骨質(zhì)增生疼痛中藥方劑的藥酒質(zhì)量評估指紋圖譜的分析。

圖1 藥酒水相AD（浸制1，3個月）的HPLC譜圖

2.4 藥酒水相AD的NMR分析

圖2 水相AD的1H-NMR譜圖

圖3 水相AD的13C-NMR譜圖

將AD經(jīng)短的硅膠柱（流動相為95%的乙醇）過濾并濃縮后得到黃褐色黏稠狀的固形物。以D2O為溶劑制成褐色透明的NMR樣品，對AD的1H-NMR和13C-NMR譜圖分析分別如圖2和圖3所示。圖1中，主要吸收峰的化學(xué)位移多集中在3.2～3.8ppm（-CH2-OH、-CH2-OR）區(qū)域，還有少量位于1.1～1.4，1.8～2.2ppm區(qū)域的（烷基）吸收峰，幾乎未出現(xiàn)6～8ppm芳香烴類的特征峰。圖2中，吸收峰主要集中在60-80ppm（C-O、C-O-R）區(qū)域，還有7～8個中強峰位于80～150ppm區(qū)域。此外25～45ppm區(qū)域也有幾個弱的吸收峰，沒有出現(xiàn)180ppm以上的羰基、羧基等官能團的特征峰。因此可基本排除水相AD中具有芳烴骨架的黃酮類、醌類以及脂肪酸等化合物的大量存在，推測水相AD組分中主要含有一些多糖-寡糖類化合物。

2.5 水提藥液的濃縮分離及其鎮(zhèn)痛活性評價

將與藥酒同等量的中草藥用傳統(tǒng)方法煎煮后過濾，得到了褐色的水提藥液。將水提藥液濃縮后得到3.2g的黑褐色固形物。加入200mL的蒸餾水，按由低到高的極性順序用有機溶劑乙醚和正丁醇逐級進行萃取。各萃取相的質(zhì)量及其含量百分比見表4，可以看出，水相WP仍然是水提藥液中含量最高的一個組分，占總量的80%～90%。

表4 水提藥液的溶劑萃取相含量百分比

水相WP的鎮(zhèn)痛活性測試，只對扭體法實驗有效，對熱板法無效。在所測劑量范圍和給藥方式下水相WP顯示了較弱的鎮(zhèn)痛活性，數(shù)據(jù)見表5。

表5 扭體法WP鎮(zhèn)痛活性的參數(shù)

3 小 結(jié)

治療骨質(zhì)增生疼痛中藥方劑的藥酒，與方劑的水提藥液相比，前者濃縮物的重量大約是后者的兩倍。藥酒水相AD的質(zhì)量也大約是水提藥液水相WP的2倍，而且水相AD的鎮(zhèn)痛活性明顯高于水相WP。結(jié)果說明治療骨質(zhì)增生疼痛中藥方劑的藥酒，從鎮(zhèn)痛活性有效成分的含量和藥用效果來看，都明顯優(yōu)于水提藥液。因此治療骨質(zhì)增生疼痛中藥方劑的配制，應(yīng)以高度白酒浸制為基準(zhǔn)，不能以水替酒。

通過不同浸制時間藥酒水相AD的HPLC譜圖曲線對比，曲線基本保持一致，重復(fù)率高，穩(wěn)定性好，表明用HPLC再輔以操作簡便的IR指紋圖譜分析可以成為治療骨質(zhì)增生疼痛中藥方劑藥酒的質(zhì)量檢測方法。

[1]Vijaykumar MB.Concept of Comprehensive Treatment for Osteoarthritis[J].Curr Med Chem Immun Endoc Metab Agents,2005,5(2):229-237.

[2]Cai QS,Wang H.Observation on the therapeutic effect of Clapping acupoint for treatment of Hypersteogeny of Lumbar Vertebra[J].J Acupunt Tuina Sci,2003,1(2): 54-55.

[3]呂曉川,王蘭格.骨關(guān)節(jié)炎藥物治療現(xiàn)狀與展望[J].中國實用內(nèi)科雜志,2006,26(27): 1901-1902.

[4]朱惠芬.一種治骨質(zhì)增生及關(guān)節(jié)疼痛的中藥制劑[P].中國專利:CN 101181568A,公開日: 2008-05-21.

[5]楊萬青.一種治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕、各種骨質(zhì)增生的藥酒[P].中國專利: CN 101214318A,公開日: 2008-07-09.

[6]徐榮高.治療頸、肩、腰、腿筋骨疼痛的中藥酒劑及其制備方法[P].中國專利: CN 101040939A,公開日: 2007-09-26.

[7]段梅莉,朱月珍,陸雅臣.一種治療骨質(zhì)增生所致疼痛等疾病的藥酒[P].中國專利: CN 101703596 A,公開日:2010-05-12.