10個甜、糯玉米品種SSR 指紋庫的建立及應(yīng)用

包 斐，王桂躍

(浙江省東陽玉米研究所，浙江 東陽 322100)

隨著我國玉米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，玉米新品種越來越多，有關(guān)品種遺傳背景、遺傳關(guān)系的研究逐漸深入到分子水平。簡單重復(fù)序列 (simple sequence repeat，SSR)是一種普遍存在于生物基因組中的DNA 片段，并且在不同生物或者相同生物的不同亞種中存在多樣性。SSR 在玉米基因組中也廣泛存在，利用SSR 兩端的保守序列來設(shè)計(jì)引物，通過PCR 擴(kuò)增和電泳檢測，可以將這種多樣性用圖譜的形式表現(xiàn)出來［1］。SSR 指紋庫是將玉米品種不同位點(diǎn)的SSR 多樣性數(shù)據(jù)整合、記錄和編碼，使之成為在一定程度上能夠描述該品種遺傳特性的數(shù)據(jù)庫。試驗(yàn)通過構(gòu)建10個甜、糯玉米雜交品種的F1代及其親本的SSR 指紋庫，探討數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的數(shù)據(jù)要素，分析數(shù)據(jù)庫擴(kuò)展及其在純度分析、遺傳相似性研究中的應(yīng)用，以便為甜、糯玉米種質(zhì)資源的遺傳分析提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

參試材料為浙江省甜、糯玉米審定品種浙甜6號，浙甜8號，浙甜9號，超甜135，超甜4號，浙糯玉2號，浙糯玉3號，浙糯玉4號，浙糯玉5號，以及2010-2011年省區(qū)試優(yōu)秀參試品系花甜糯072。均由東陽玉米研究所選育并提供。

1.2 引物

參考不同引物在玉米指紋庫構(gòu)建、品種聚類分析中的應(yīng)用情況及在使用中的表現(xiàn)情況綜合選擇了40 對引物 (均可在www.MaizeGDB.com 上搜索到)作為SSR 指紋庫的建庫引物 (表1)。

表1 40 對適合信息庫構(gòu)建的SSR 引物

1.3 DNA 提取及電泳方法

采用CTAB 法提取植株葉片總DNA。運(yùn)用毛細(xì)管熒光電泳技術(shù)檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得SSR圖譜數(shù)據(jù)，并整理構(gòu)建各試驗(yàn)材料的SSR 指紋庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 指紋庫

根據(jù)SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜，在有譜帶(或特征峰，以下均稱譜帶)的地方記為1，無譜帶的地方記為0，獲得各試驗(yàn)材料的SSR 指紋庫。表2 為各試驗(yàn)材料的SSR40個引物中的2 對引物圖譜信息 (由于數(shù)據(jù)庫較大，僅列舉2 對引物圖譜信息)。

表2 各玉米品種及其親本材料在2個引物位點(diǎn)的SSR 指紋

表2 可以看出，本試驗(yàn)在引物umc1705w1 位點(diǎn)共檢測出了6個等位變異，在引物umc1999Y3位點(diǎn)共檢測出了4個等位變異。各引物等位位點(diǎn)以該位點(diǎn)特征譜帶的片段大小來命名，不同試驗(yàn)材料擴(kuò)增圖譜數(shù)據(jù)以0，1 的數(shù)據(jù)形式對號入座。

2.2 SSR 指紋庫的應(yīng)用

2.2.1 純合度分析

自交系材料在其選育過程中由于逐代自交，各等位基因趨于純合，純合程度越高該自交系越穩(wěn)定。因?yàn)榛蚪M的龐大和等位基因的復(fù)雜多樣，一般對于自交系純合程度很難用一個明確的指標(biāo)進(jìn)行衡量。試驗(yàn)在SSR 指紋庫的基礎(chǔ)上，計(jì)算SSR 純合引物位點(diǎn)占所有檢測引物位點(diǎn)的比例，嘗試對各試驗(yàn)材料的純合度進(jìn)行分析。

從表3 可以看出，親本自交系比單交種純合度高，純合度最高的是浙糯玉2號的父、母本和浙糯玉3號的母本，達(dá)到97.4%;純合度最低的是浙甜9號的父本為73.0%。單交種的純合度主要受父母本共同擁有的等位基因數(shù)的影響。純合度最低的是浙甜6號，為35.1%，最高為花甜糯072，達(dá)到67.6%。

表3 各玉米品種及其親本的純合度

2.2.2 篩選出可用于品種純度鑒定的SSR 引物

在單交種生產(chǎn)過程中，由于親本種子的混雜而影響單交種種子純度的情況時有發(fā)生，篩選出具有雙親互補(bǔ)帶型的SSR 引物，并利用其對單交種種子進(jìn)行檢測，可以直接對種子進(jìn)行純度測定，快速高效的檢測出單交種中的親本混雜［2］。試驗(yàn)在SSR指紋庫的基礎(chǔ)上，篩選出對各品種具有雙親互補(bǔ)帶型的SSR 引物2 組 (表4)，用于檢測該品種種子的純度，其中第2 組引物作為補(bǔ)充引物。

表4 適用于玉米單交種純度檢測的特異引物

3 小結(jié)與討論

目前SSR 指紋庫數(shù)據(jù)的記錄方法主要有2種，一種基于PAGE 凝膠電泳，其圖譜數(shù)據(jù)是根據(jù)特征譜帶的數(shù)量及其相互位置確定，以0，1 表示;另一種是在引物末端加入熒光標(biāo)記，并利用毛細(xì)管熒光電泳檢測出擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小，并直接記錄特征產(chǎn)物的片段大小作為圖譜數(shù)據(jù)。PAGE 凝膠電泳檢測不同樣品DNA 片段大小是通過與Marker 比較得出，但不可能每個泳道都加入Marker，所以片段大小只能用肉眼比較估測，因此數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性受到一定的影響。而熒光電泳通過DNA 分析儀能夠準(zhǔn)確的得出DNA 片段的大小，準(zhǔn)確性更高，同時由于確定了各個引物的BIN，所以不同批次，不同時間的檢測數(shù)據(jù)均能夠很好的整合到數(shù)據(jù)庫中［1-3］。本試驗(yàn)中SSR 指紋以0，1 記錄，但各引物等位位點(diǎn)譜帶的大小已經(jīng)確定，便于不同的圖譜數(shù)據(jù)對號入座，這種記錄方式除較普通的0，1 指紋更容易數(shù)據(jù)整合外，還有利于數(shù)據(jù)進(jìn)一步的開發(fā)利用。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，浙甜9號父本和超甜135 母本的純合度相對較低，說明這2個自交系可能存在一定程度的混雜退化，需要引起重視并進(jìn)行必要的提純工作。親本自交系的純合程度直接影響了F1代的雜種優(yōu)勢，利用SSR 指紋庫數(shù)據(jù)計(jì)算純合位點(diǎn)的比例，可直觀反映出一個自交系材料的純合度，用于長期監(jiān)測自交系材料的穩(wěn)定性情況。

運(yùn)用SSR 標(biāo)記對玉米單交種的純度測試已經(jīng)在國內(nèi)多個實(shí)驗(yàn)室獲得成功［4-7］，與RFLP 相比效率更高［8］。試驗(yàn)篩選出2 對適合玉米單交種純度檢測的SSR 特異引物，對制種過程中產(chǎn)生的親本混雜的情況能夠很好的進(jìn)行測定，與傳統(tǒng)的田間觀察相比較而言準(zhǔn)確性更高，速度更快，能大大提高檢測效率。

SSR 用于真?zhèn)舞b定已經(jīng)在不同生物種群開展［3，9］。目前玉米品種的真?zhèn)舞b定，需要通過品種DUS 測試來認(rèn)定。利用SSR 多樣性對品種真?zhèn)芜M(jìn)行鑒定，需要嚴(yán)格篩選建庫引物，明確界定入庫數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)，建立品種SSR 指紋庫，并結(jié)合形態(tài)性狀的鑒定結(jié)果來綜合說明［10-11］。本試驗(yàn)建立的SSR 指紋庫在各個引物位點(diǎn)上檢測到的等位基因數(shù)量有限，需進(jìn)一步增加檢測材料，將可能出現(xiàn)的新等位變異補(bǔ)充到現(xiàn)有的引物位點(diǎn)內(nèi)，并逐步使入庫數(shù)據(jù)更加規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化，為品種的真?zhèn)舞b定和遺傳分析，提供幫助。

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