羥基脲增強腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)的K562細胞凋亡及其分子機制

武瑤珉，張亞璽，史 娟，劉士廉，劉彥信，鄭德先

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京100005

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體 (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)能夠選擇性地誘導(dǎo)多種腫瘤細胞的凋亡，而對大多數(shù)正常細胞無毒害，所以，自從其被發(fā)現(xiàn)以來，人們一直在試圖將TRAIL用于腫瘤治療［1-2］。臨床試驗結(jié)果證實，重組可溶性TRAIL(recombinant soluble tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，rsTRAIL)對一些類型的白血病患者治療效果非常顯著。慢性髓細胞性白血病 (chronic myelogenous leukemia，CML)來源的K562細胞能抵抗rsTRAIL引起的凋亡，并且對多種化療藥物的細胞毒作用不敏感［3-4］。K562細胞在CML中發(fā)揮了腫瘤干細胞的角色，是癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因，成為癌癥治療的靶向目標(biāo)［5］。本研究探討人重組可溶性TRAIL與羥基脲(hydroxyurea，HU)對K562細胞的協(xié)同性毒性作用，旨在證明其具體的分子機制，為CML的治療提供理論支持，具有一定的應(yīng)用前景。

材料和方法

試劑羥基脲購自Sigma公司，rsTRAIL由本實驗室純化制備?？贵w分別購自Santa Cruz公司 (FLIP sc-7108，c-IAP1 sc-7943)和 Cell Signaling公司 ［Ras抗體 #3965，phospho-SAPK/JNK抗體 #9251，SAPK/JNK抗體 #9252，phospho-p44/42 MAPK(Erk 1/2)抗體 #9101，p44/42 MAPK(Erk 1/2)抗體 #9102，phospho-MEK 1/2抗體 #9121，MEK 1/2抗體 #9122］。

細胞株及培養(yǎng)K562和SVT-35細胞株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。兩種細胞均在37℃、5%CO2、恒溫、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，兩種細胞的生長培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，48h傳代1次，選用對數(shù)生長期細胞進行實驗。

四唑氮鹽法檢測細胞生長抑制率

單獨用藥:取對數(shù)生長期的K562、SVT-35細胞接種于96孔平底培養(yǎng)板，每孔100 μl，使細胞懸液的終濃度為2.5×105/ml。分別各自加入終濃度為0.25、0.50、1、2 μg/ml 的 rsTRAIL 和 50、100、200和400 μg/ml的HU，對照組細胞加等量培養(yǎng)基，每個濃度接種3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后加入20 μl四唑氮鹽+吩嗪硫酸甲酯，培養(yǎng)2～4 h，酶標(biāo)儀492 nm測光密度值 (optical density，OD)，計算細胞生長抑制率［細胞生長抑制率=(1-OD處理組/OD對照組)×100%］。根據(jù) TRAIL敏感性定義，即:用100 ng/ml的TRAIL處理細胞，多于60%的細胞死亡為敏感;少于25%的細胞死亡為不敏感，二者之間為中度敏感。

聯(lián)合用藥:分別加入終濃度為0.25、0.50、1、2 μg/ml的HU，然后每個HU組分別加入終濃度為250、500、1000、2000和 4000 ng/ml的 rsTRAIL，每個濃度接種3個復(fù)孔，孵育24 h后測定細胞生長抑制率，計算方法同上。

判斷兩種藥物是否產(chǎn)生協(xié)同作用，標(biāo)準(zhǔn)有以下兩種:(1)作圖法:將兩種藥物單獨處理的凋亡率(細胞存活抑制率)疊加，與聯(lián)合應(yīng)用的凋亡率在柱狀圖中作比較，若前者明顯小于后者，則對兩組原始數(shù)據(jù)進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義; (2)采用國內(nèi)金 (正均)氏公式，Q=EA+B/(EA+EB-EAEB)。EA為A藥 (rsTRAIL)單獨處理的細胞生長抑制率，EB為B藥 (各種化療藥物)單獨處理的細胞生長抑制率，EA+B為兩種藥物聯(lián)合處理的細胞生長抑制率。Q值介于0.85～1.15為單純相加，介于1.15～2.0為聯(lián)合作用有所增強，大于2.0為明顯增強，介于0.85～0.55為二者存在拮抗作用，小于0.55為明顯拮抗［6］。

細胞裂解K562細胞經(jīng)特定的處理后，在4℃、1000×g離心5 min，收集細胞，用冰預(yù)冷的PBS洗兩次。用添加了蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液重懸細胞，使細胞懸液的終濃度為5.0×104/ml。冰上裂解30 min，4℃、15 000×g離心去除細胞核和細胞碎片，備用。

Western blot檢測蛋白質(zhì)含量或磷酸化水平用BCA法檢測細胞裂解液中蛋白質(zhì)濃度，并且根據(jù)測定的數(shù)值制備蛋白質(zhì)凝膠電泳樣品，每個樣品含60 μg總蛋白，經(jīng)8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，用半干電轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，進行免疫印跡實驗。用5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入封閉液稀釋的一抗，室溫孵育1.5 h或4℃過夜，經(jīng)TBST洗滌3遍后，加入封閉液稀釋的相應(yīng)的二抗，室溫孵育1.5 h，經(jīng)TBST洗滌3遍后，ECL顯色液中避光反應(yīng)1 min，X-光膠片顯影。

統(tǒng)計學(xué)處理用方差分析比較不同實驗組中數(shù)據(jù)差異的統(tǒng)計學(xué)意義，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

K562細胞對rsTRAIL的細胞毒作用選擇用rsTRAIL同時處理K562細胞和對rsTRAIL凋亡作用相對敏感的細胞株SVT-35。細胞存活率測定結(jié)果顯示，當(dāng) rsTRAIL處理濃度為 0.5、1和 2 μg/ml時，SVT-35細胞存活率分別為55%、32%和24%，K562細胞的存活率分別為98%、93%和82%。K562細胞對rsTRAIL不敏感 (圖1)。

rsTRAIL和HU聯(lián)合作用對K562細胞的影響用rsTRAIL和HU分別單獨處理和聯(lián)合處理K562細胞，結(jié)果顯示在 rsTRAIL(0.25、0.5、1 μg/ml)和 HU(50、100、200和400 μg/ml)不同濃度下，聯(lián)合處理組對K562細胞生長的抑制率高于兩種藥物單獨處理對該細胞生長的抑制率之和 (P＜0.05，P＜0.01)，rsTRAIL與HU在多種處理條件下存在著協(xié)同作用(圖2)。

金 (正均)氏公式分析結(jié)果顯示，在不同濃度的rsTRAIL與HU聯(lián)合處理的所有條件下，兩者均存在著協(xié)同作用 (Q值均大于1.15)(表1)。

rsTRAIL和HU對K562細胞的協(xié)同作用機制在聯(lián)合處理組的不同處理時間均檢測到Ras的活化受到抑制，rsTRAIL與 HU聯(lián)合處理4和24h能引起MEK1/2活性的下調(diào)，即Ras-Raf-MEK1/2信號通路參與調(diào)節(jié)了K562細胞對rsTRAIL和HU聯(lián)合處理的細胞凋亡變化 (圖3A);與對照組相比，JNK的磷酸化水平在聯(lián)合處理1和4h的樣品中明顯升高，與K562細胞表現(xiàn)出的對藥物引起的凋亡敏感性一致 (圖3B)。

圖1 rsTRAIL處理后K562和SVT-35細胞的存活曲線Fig 1 Viability curve of K562 and SVT-35 cells treated with rsTRAIL

rsTRAIL和HU聯(lián)合處理K562細胞對細胞凋亡抑制蛋白1(cellular inhibitor of apoptosis protein-1，c-IAP1)和細胞型Fas相關(guān)死亡區(qū)域樣白介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(cellular Fas associated death domain protein-like interleukin-1 beta-convening enzyme inhibitory protein，c-FLIP)表達的影響rsTRAIL和HU聯(lián)合處理K562細胞，cFLIP和cIAP1的表達在兩種藥物聯(lián)合處理1、4及24 h后均受到不同程度的抑制(圖4)。

討 論

TRAIL能夠選擇性地誘導(dǎo)多種腫瘤細胞的凋亡，而對大部分正常細胞無毒副作用。TRAIL通過與其分布于細胞表面的兩種死亡受體DR4和DR5結(jié)合誘導(dǎo)凋亡，它激活的是外源性細胞凋亡通路［7］?；熕幬锱cTRAIL不同的是，它通過引發(fā)細胞損傷，激活p53基因，通過內(nèi)在凋亡通路介導(dǎo)細胞凋亡［8］。許多癌細胞具有p53基因突變，導(dǎo)致它們能抵抗化療藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡［9］。有報道TRAIL誘導(dǎo)的外源性凋亡通路產(chǎn)生的促凋亡信號有可能逾越這種抵抗作用［10］。

圖2 HU和rsTRAIL聯(lián)合處理K562細胞后的生長抑制率Fig 2 Effects of HU and rsTRAIL on the viability of K562 cells

表1 金 (正均)氏公式表示rsTRAIL和HU的協(xié)同作用Table 1 Synergistic effects of rsTRAIL in combination with HU are judged by King's formula

圖3 rsTRAIL與HU聯(lián)合處理抑制K562細胞的Ras-Raf-MEK信號通路Fig 3 Combination of rsTRAIL with HU results in the inhibition of Ras-Raf-MEK signaling pathway

圖4 Western blot顯示HU和rsTRAIL聯(lián)合處理K562細胞，其凋亡抑制蛋白的變化Fig 4 Expression of apoptosis inhibitor in K562 cells treated with the combination of rsTRAIL and HU under Western blot

CML是白血病的一種，產(chǎn)生于造血干細胞的惡性轉(zhuǎn)化，其特點是在9和22號染色體中發(fā)生平衡易位，產(chǎn)生融合基因bcr-abl，編碼的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶具有異常增高的酪氨酸激酶活性，是CML的關(guān)鍵致病原因［11-12］。突變導(dǎo)致在bcr-abl轉(zhuǎn)化的細胞中多種信號通路被激活，賦予多能造血祖細胞的特性，使之遠高于正常細胞的生長和生存優(yōu)勢，減少生長因子的依賴性和凋亡［4］。BCR-ABL使細胞色素C從線粒體向胞漿釋放受阻，阻斷半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶9和3的活化，抑制凋亡發(fā)生。臨床試驗和研究結(jié)果表明，CML患者和CML來源的細胞都具有抵抗TRAIL細胞毒作用的能力。本研究使用的一株CML來源的K562細胞，不僅具有抵抗TRAIL細胞毒作用的能力，而且是p53缺陷型［13］，能抵抗多種化療藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡。目前針對CML的常規(guī)治療為化療藥物治療，方法單一，副作用大，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［14］。研究可應(yīng)用于CML的臨床治療方案是本研究的目的。本研究使用的rsTRAIL與天然TRAIL蛋白具有相同的生物學(xué)活性［15］。本研究首先檢測K562細胞對rsTRAIL的敏感性，發(fā)現(xiàn)其對rsTRAIL極不敏感。接著選取了作用機制和類型不同的多種化療藥物，與rsTRAIL聯(lián)合處理K562細胞，篩選到了一種能與rsTRAIL產(chǎn)生協(xié)同作用的化療藥物:HU。

HU是一種抗代謝類的化療藥物，是核苷二磷酸還原酶抑制劑，可阻止核苷酸還原為脫氧核苷酸，干擾嘌呤及嘧啶堿基生物合成，選擇性地阻礙DNA合成，對RNA及蛋白質(zhì)合成無阻斷作用［16］，有致白細胞和血小板減少、引發(fā)胃腸道反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和脫發(fā)等不良反應(yīng)［17］。與TRAIL聯(lián)用，可明顯降低使用劑量，減少對機體的毒副反應(yīng)。本研究報道了對TRAIL和許多化療藥都不敏感的K562細胞株經(jīng)rsTRAIL和HU聯(lián)合處理，在增進細胞凋亡方面能產(chǎn)生協(xié)同作用。

具有組成性活性的酪氨酸激酶BCR-ABL能作用于其他與凋亡、增殖以及分化相關(guān)的激酶［18-19］。TRAIL能通過其受體激活細胞內(nèi)JNK，一旦JNK被激活，JNK蛋白就會進入到細胞核內(nèi)，磷酸化激活c-Jun，增進基因的表達，從而促進細胞凋亡的發(fā)生。絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一類能對細胞外多種刺激作出相應(yīng)反應(yīng)的絲/蘇氨酸蛋白激酶，MEK1/2是MAPKs的一個成員，在細胞的生長分化和凋亡方面發(fā)揮作用，抑制MEK1/2的活性能提高腫瘤細胞對細胞毒性藥物的敏感性。Ras(GTP結(jié)合蛋白)活化［20］，可以誘導(dǎo)下游事件:Raf(MAPKKK)活化，導(dǎo)致MEK1/2(MAPKK)活化，繼續(xù)活化MAPK，進入細胞核激活其他激酶或基因調(diào)控蛋白 (轉(zhuǎn)錄因子)。本研究顯示HU和rsTRAIL產(chǎn)生的協(xié)同凋亡作用能引起 Ras、MEK、ERK等分子活性下降，提示參與了K562細胞敏感性的變化。本研究報道了rsTRAIL和HU聯(lián)合處理K562細胞，在增強細胞敏感性方面產(chǎn)生的協(xié)同作用是通過抑制Ras-Raf-MEK1/2通路而實現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn)的如上一些激酶參與調(diào)控了K562細胞的增敏過程，但究竟是如何發(fā)揮作用的，目前尚不明確，有待于進一步的實驗證明。

凋亡途徑有兩條:包括外源性通路和內(nèi)在凋亡通路。TRAIL能引起腫瘤細胞經(jīng)外源性通路發(fā)生凋亡。c-FLIP可干擾半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶8的活性，是凋亡信號通路中的抑制蛋白。c-IAP1是存在于細胞質(zhì)中的抗凋亡蛋白，有泛素蛋白連接酶活性，能與半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3特異性結(jié)合，通過抑制半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3的切割抑制細胞的凋亡。而化療藥物通過引發(fā)細胞損傷，由此激活p53基因，從而激活內(nèi)在凋亡通路。本研究外源性途徑中的凋亡抑制蛋白c-FLIP、c-IAP1參與其中［21］，這兩種半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶的抑制蛋白的表達水平經(jīng)藥物聯(lián)合處理后均下降，提示cFLIP和cIAP1在rsTRAIL和HU聯(lián)合誘導(dǎo)K562細胞凋亡時發(fā)揮重要作用，提示外源性凋亡途徑在協(xié)同作用中發(fā)揮了主要作用。

由于無一種癌癥是單因素導(dǎo)致的，在特定的藥物處理后，細胞內(nèi)發(fā)生變化的分子開關(guān)也不只一個，所以要達到治療癌癥的目的，需要盡量全面地研究癌癥的發(fā)生、維持以及對藥物的敏感性發(fā)揮作用的所有分子，才能更好更全面地把握癌癥相關(guān)的各個方面。

由于K562細胞是CML來源的淋巴祖細胞，在CML疾病的發(fā)生發(fā)展過程中充當(dāng)了腫瘤干細胞的角色，這賦予了本研究更為深刻的意義。腫瘤干細胞在腫瘤中長期存在，因為能產(chǎn)生新的腫瘤，所以是導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因［22］。CML是由白血病干細胞維持的，與其已經(jīng)分化的子細胞相比，對特異性的化療藥物有更強的抗性。因此，盡可能多地消除癌干細胞在腫瘤治療中具有極大挑戰(zhàn)性。本研究旨在針對CML來源的K562細胞對多種細胞毒性藥物存在抵抗能力，聯(lián)合常規(guī)化療藥物與rsTRAIL，扭轉(zhuǎn)該細胞的抗性，使其敏感性增強，并探討敏感性改變的機制，為提出新的治療方法并應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。

綜上，本研究顯示對TRAIL和許多化療藥都不敏感的K562細胞株中，用rsTRAIL和HU聯(lián)合處理，在增進細胞凋亡方面能產(chǎn)生協(xié)同作用。通過抑制Ras-Raf-MEK1/2通路增強該細胞的敏感性，促使細胞通過外源性途徑發(fā)生凋亡，凋亡抑制蛋白c-FLIP、c-IAP1參與外源性凋亡途徑的調(diào)控。

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