快速培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)肺炎支原體的對(duì)照研究

周燕，申旭霞

(1.成都市婦女兒童中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都610016;2.成都市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都611130)

快速培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)肺炎支原體的對(duì)照研究

周燕1，申旭霞2

(1.成都市婦女兒童中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都610016;2.成都市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都611130)

目的探討快速培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)法檢測(cè)肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae，MP)的異同。方法對(duì)2011年1～12月住院的218例疑似肺炎支原體肺炎患兒采集咽拭子，同時(shí)用快速培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)FQPCR法檢測(cè)MP。結(jié)果快速培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)FQ-PCR法診斷肺炎支原體肺炎的靈敏度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、假陰性率及診斷符合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);實(shí)時(shí)FQ-PCR法診斷肺炎支原體肺炎的特異度明顯高于快速培養(yǎng)法，假陽(yáng)性率明顯低于快速培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。二者聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值及診斷符合率分別為93.8%、90.7%和90.8%，均高于快速培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)FQ-PCR法(P＜0.05);假陰性率為6.2%，明顯低于快速培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)FQ-PCR法(P＜0.05);聯(lián)合檢測(cè)的特異度為86.7%，明顯高于快速培養(yǎng)法(P＜0.05)。結(jié)論兩種方法的敏感度差別不大，而實(shí)時(shí)FQ-PCR法的特異性優(yōu)于快速培養(yǎng)法。應(yīng)用這兩種不同方法學(xué)原理的檢測(cè)方法組合檢測(cè)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，在提高肺炎支原體感染檢出率的同時(shí)，還可以互相佐證，減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

肺炎支原體;快速培養(yǎng)法;FQ-PCR法

肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae，MP)是小兒呼吸道感染的常見(jiàn)病原體之一，主要通過(guò)呼吸道傳染;臨床表現(xiàn)多種多樣，以呼吸道感染最為多見(jiàn)，并可引起全身各臟器損害［1］。MP的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法有很多，臨床常采用血清特異性抗體及冷凝集素的檢測(cè)，但受病程制約，早期診斷較為困難。近年來(lái)發(fā)展的MP快速培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)法均具有不受病程影響、快速、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)［2，3］。為了客觀評(píng)價(jià)這兩種方法的異同，本研究對(duì)218例疑似肺炎支原體肺炎患兒采集咽拭子同時(shí)用快速培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)FQ-PCR法檢測(cè)MP，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2011年1～12月成都市婦女兒童中心醫(yī)院兒科收治的疑似MP感染的急性呼吸道感染患兒218例，其中男123例，女95例，年齡6個(gè)月至15歲，平均4歲3個(gè)月。

1.2 方法所有患兒均于就診當(dāng)日由兒科護(hù)士無(wú)菌采集咽試子標(biāo)本，同時(shí)用快速培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)FQPCR法檢測(cè)MP。操作方法均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行?？焖倥囵B(yǎng)試劑盒由鄭州市貝瑞特生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)提供;PCR法檢測(cè)試劑盒由廣州中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司生產(chǎn)提供;儀器為杭州博日l(shuí)ine gene實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀。

1.3 小兒肺炎支原體肺炎臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)［9，10］①持續(xù)劇烈咳嗽;②全身癥狀比胸部體征明顯;③X射線所見(jiàn)較體征顯著，胸片可見(jiàn)兩肺均勻一致的片狀陰影成似大葉性肺炎改變，肺門(mén)陰影增濃;④白細(xì)胞計(jì)數(shù)正?；蛏愿?，血沉多增快;⑤應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類效果好，其他抗生素如青霉素，頭孢無(wú)效。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)兩種方法的陽(yáng)性檢出率比較采用配對(duì)McNemar檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 快速培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果將快速培養(yǎng)法同小兒肺炎支原體肺炎臨床診斷進(jìn)行比較，其對(duì)小兒肺炎支原體肺炎診斷的靈敏度、特異度分別為82.0%、76.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)、陰性預(yù)測(cè)值(NPV)分別為83.3%和75.0%，假陽(yáng)性率、假陰性率分別為23.3%、18.0%，診斷符合率為79.8%，見(jiàn)表1。

表1 快速培養(yǎng)法檢測(cè)MP結(jié)果和臨床診斷結(jié)果比較(n)

2.2 實(shí)時(shí)FQ-PCR法檢測(cè)結(jié)果將實(shí)時(shí)FQ-PCR法同小兒肺炎支原體肺炎臨床診斷進(jìn)行比較，其對(duì)小兒肺炎支原體肺炎診斷的靈敏度、特異度分別為76.6%、91.1%，PPV、NPV分別為92.5%和73.2%，假陽(yáng)性率、假陰性率分別為8.9%、23.4%，診斷符合率為82.6%，見(jiàn)表2。

表2 實(shí)時(shí)FQ-PCR法檢測(cè)MP結(jié)果和臨床診斷結(jié)果比較(n)

2.3 快速培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)FQ-PCR法聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果將快速培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)FQ-PCR法聯(lián)合檢測(cè)同小兒肺炎支原體肺炎臨床診斷進(jìn)行比較，其對(duì)小兒肺炎支原體肺炎診斷的靈敏度、特異度分別為93.8%、86.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)、陰性預(yù)測(cè)值(NPV)分別為90.9%、90.7%，假陽(yáng)性率、假陰性率分別為13.3%、6.2%，診斷符合率為90.8%，見(jiàn)表3。

表3 快速培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)FQ-PCR法聯(lián)合檢測(cè)和臨床診斷結(jié)果比較(n)

2.4 三種檢測(cè)結(jié)果比較快速培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)FQPCR法診斷肺炎支原體肺炎的靈敏度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、假陰性率及診斷符合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);實(shí)時(shí)FQ-PCR法診斷肺炎支原體肺炎的特異度明顯高于快速培養(yǎng)法，假陽(yáng)性率明顯低于快速培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而兩者聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值及診斷符合率均高于快速培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)FQ-PCR法，假陰性率均明顯低于快速培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)FQ-PCR法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);并且兩者聯(lián)合檢測(cè)的特異度明顯高于快速培養(yǎng)法(P＜0.05)?？焖倥囵B(yǎng)法與實(shí)時(shí)FQPCR法受原理及試劑等諸多因素的影響，檢測(cè)MP結(jié)果不完全一致(一致率76.1%)，見(jiàn)表4。

表4 快速培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)FQ-PCR法檢測(cè)MP結(jié)果的符合率

3 討論

近幾年來(lái)，MP感染所致的呼吸道疾病逐年增多，多發(fā)生于兒童，臨床表現(xiàn)多種多樣，病情輕重不等，病程長(zhǎng)，易反復(fù)，肺外并發(fā)癥較多見(jiàn)［1］。因其對(duì)常用抗生素不敏感，經(jīng)驗(yàn)用藥易延誤病情，增加患兒痛苦和加重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此早期診斷對(duì)臨床的治療尤為重要。目前，臨床上用于MP感染早期檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室方法最常見(jiàn)的是快速培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)FQ-PCR法。

快速培養(yǎng)法是近年發(fā)展起來(lái)的一種直接檢測(cè)MP病原體的實(shí)驗(yàn)室方法，具有簡(jiǎn)便，快速，敏感的優(yōu)點(diǎn)［2］。該方法在發(fā)病初期也能檢測(cè)得到MP，因其培養(yǎng)液中含有高營(yíng)養(yǎng)成分和快速生長(zhǎng)因子，標(biāo)本中只需含有極少量的病原體即可迅速增殖，能在12～24小時(shí)得出結(jié)果［4.8］。但是快速培養(yǎng)法的特異性不是很高，在本研究的特異度為76.7%。實(shí)時(shí)FQPCR法近幾年應(yīng)用于MP感染的早期檢測(cè)，是一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的新技術(shù)，它可以在短時(shí)間內(nèi)使極微量的核酸片斷擴(kuò)增至數(shù)百萬(wàn)個(gè)拷貝，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和簡(jiǎn)便快捷的優(yōu)點(diǎn)。David等報(bào)道實(shí)時(shí)FQ-PCR法檢測(cè)MP的靈敏度為60%，特異度為96.7%［5］，與本研究的結(jié)果一致。但其主要的缺點(diǎn)是單一的實(shí)時(shí)FQ-PCR法不足以診斷MP感染［6，7］。

本研究顯示兩種方法檢測(cè)MP一致率為76.1%，有52例結(jié)果不一致，分析原因如下:①可能與快速培養(yǎng)法使用的培養(yǎng)液有關(guān)，標(biāo)本中的真菌也能在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)引起假陽(yáng)性［4］;②盡管PCR技術(shù)不斷改善，但僅靠這一種方法診斷MP感染是不夠的［6，7］，并且易受標(biāo)本來(lái)源和試劑特異性的影響;③快速培養(yǎng)法只有在MP存活的情況下才能夠檢出，而PCR法并不依賴這一點(diǎn)?？焖倥囵B(yǎng)法與實(shí)時(shí)FQ-PCR法聯(lián)合檢測(cè)靈敏度達(dá)93.8%，PPV和NPV分別達(dá)90.9%和90.7%，診斷符合率達(dá)90.8%，假陰性率低至6.2%，說(shuō)明在MP感染的早期診斷時(shí)，需要聯(lián)合使用兩種方法，取長(zhǎng)補(bǔ)短，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

總之，快速培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)FQ-PCR法檢測(cè)MP各有其特點(diǎn)，如能將兩種方法結(jié)合用于MP感染的早期檢測(cè)，不但有利于疾病的診斷，而且可以有效的避免漏檢，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，為臨床醫(yī)生提供快速可靠的檢驗(yàn)依據(jù)。

［1］倪語(yǔ)星，尚紅.臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)［M］.第4版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007:304-308.

［2］屈玲，李芳芹，艾芳.肺炎支原體快速培養(yǎng)法在兒童呼吸道感染中的應(yīng)用［J］.延安大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2009，7(3):121.

［3］Morozumi M，Ito A，Murayama S，et al.Assessmengt of real-time PCR for diagnosis of Mycoplasma pneumorniae pneumornia in pediatric patients［J］.Can J Microbiol，2006，52(2):125-129.

［4］謝世營(yíng)，黃和明，韋升市，等.肺炎支原體液體培養(yǎng)方法的應(yīng)用［J］.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2009，27(1):55-56.

［5］David P，Victoria JC，Carmen S，et al.Real-time detection of Mycoplasma pneumorniae in respiratory samples with an intemal processing control［J］.J Med Microbiol，2006，55(2):149-155.

［6］Daxboeck F，Krause R，Wenisch C.Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumorniae infection［J］.Clin Microbiol Infect，2003，9(4):263-273.

［7］Ursi D，Ieven M，Noordhoek GT，et al.An interlaboratory comparison for the detection of Mycoplasma pneumorniae in respiratory samples by the polymerase chain reaction［J］.J Microbiol Methods，2003，53(3):289-294.

［8］馮云，楊湛斐.肺炎支原體培養(yǎng)假陽(yáng)性淺析［J］.中華臨床醫(yī)學(xué)研究雜志，2005，11(3):350-351.

［9］沈曉明，王衛(wèi)平.兒科學(xué)［M］.第7版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:208.

［10］劉群，袁成遠(yuǎn).小兒肺炎支原體肺炎176例臨床分析［J］.實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2009，6(5):91-92.

Control study of rapid culture method and real-time of FQ-PCR method for detecting myco-plasma pneumoniae

ZHOU Yan1，SHEN Xu-xia2(1.Women and Children Center Hospital of Chengdu，Chengdu 610016，China;2.The Fifth People's Hospital of Chengdu，Chengdu 611130，China)

ObjectiveTo explore the rapid culture method and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR)，to detect the similarities and differences of the Mycoplasma pneumoniae(MP).Methodscollecting 218 cases of suspected Mycoplasma pneumoniae throat swabs and rapid culture method and real-time of FQ-PCR method detection of Mycoplasma pneumoniae in our hospital from January to December in 2011.ResultsThe sensitivity，positive predictive value，y false negative rate and diagnosis in line with the rate of Rapid culture method and real-time of FQ-PCR had no significant differences(P＞0.05);the specificity of real-time of FQ-PCR was higher than rapid culture method，the false positive rate was significantly lower than the rapid culture method，the difference was statistically significant(P＜0.05);sensitivity，negative predictive value and diagnostic coincidence rate of the joint detection was respectively 93.8%，90.7%and 90.8%，higher than the rapid culture method and real-time of FQ-PCR method(P＜0.05);false negative rate was 6.2%，significantly lower than the rapid culture method and real-time FQ-PCR method(P＜0.05);the specificity of the joint detection was 86.7%，significantly higher than rapid culture method(P＜0.05).ConclusionThe sensitivity of the two methods has no significant difference，the specificity of real-time of FQ-PCR method is better than rapid culture method.The joint detection of these two methods can improve the Mycoplasma pneumoniae infection detection rate，reduce experimental error and improve detection accuracy.

Mycoplasma pneumoniae;Rapid culture method;Real-time of FQ-PCR method

R375.2;R349.82

A

1672-6170(2012)05-0094-03

2012-04-28;

2012-07-19)