染料高效脫色光合細(xì)菌的分離與分析

李彥芹，昌艷萍，李春青，陳涵茜，康現(xiàn)江

（河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002）

染料高效脫色光合細(xì)菌的分離與分析

李彥芹，昌艷萍，李春青，陳涵茜，康現(xiàn)江

（河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002）

為增強(qiáng)染料廢水的生物處理，從印染廠的污泥中分離篩選出1株高效脫色光合細(xì)菌HL．對(duì)其在不同p H、碳源和氮源的條件下對(duì)5種染料的脫色效果進(jìn)行了研究．結(jié)果表明，菌株HL菌落呈鮮紅色，圓形、光滑、濕潤(rùn)、稍突起、邊緣整齊，直徑0．5～2．0 mm；個(gè)體呈螺旋狀，單根極生鞭毛，革蘭氏染色為陰性，含有細(xì)菌葉綠素a，可進(jìn)行光合作用．對(duì)活性艷紅和直接胡蘭的脫色效果顯著，特別是對(duì)直接胡蘭在24 h內(nèi)脫色率達(dá)到100%．菌株HL在中性環(huán)境下，分別以葡萄糖和氯化銨作為脫色培養(yǎng)基的碳源和氮源時(shí)，對(duì)直接胡蘭的脫色率和降解率分別達(dá)到100%和98．67%．

光合細(xì)菌；印染廢水；脫色率；降解率

印染和染料工業(yè)是現(xiàn)代工業(yè)中對(duì)環(huán)境污染比較嚴(yán)重的行業(yè)，其產(chǎn)品在生產(chǎn)和使用過(guò)程中大約有10%～20%的染料會(huì)直接隨廢水進(jìn)入環(huán)境中［1］．染料脫色是印染廢水處理過(guò)程中關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一［2］，用常規(guī)生化處理技術(shù)難以達(dá)到有效脫色的目的．光合細(xì)菌可以有效地利用水中過(guò)剩的有機(jī)物作為自身繁殖的營(yíng)養(yǎng)源，迅速分解水中氨、硫化氫、酸類(lèi)等有害物質(zhì)，大幅度降低水體的污染指標(biāo)，在污水處理、水體凈化等方面得到廣泛關(guān)注［3－9］．

本實(shí)驗(yàn)從保定某印染廠所排放的污泥中分離得到1株具有高效脫色能力的光合細(xì)菌，為光合細(xì)菌應(yīng)用于實(shí)際印染工業(yè)廢水的脫色提供借鑒．

1 材料

1．1 分離樣品來(lái)源

樣品采自保定某印染廠含有染料的污泥和污水．

1．2 染料

酸性黑NG、活性艷紅、活性艷蘭、直接胡蘭、直接翠蘭，它們的最大吸收波長(zhǎng)分別為607，520，599，616，620 nm．將5種染料在無(wú)菌操作下分別配制成質(zhì)量濃度為10 mg／m L的染料溶液備用．

1．3 培養(yǎng)基

富集分離培養(yǎng)基（g／L）：NH4Cl 1．0，MgCl20．1，醋酸鈉3．0，CaCl20．1，KH2PO40．6，K2HPO40．4，酵母膏0．1，水1 L，p H 7．2，121℃ 滅菌30 min．

斜面培養(yǎng)基（g／L）：酵母膏10，MgSO4·7H2O 0．5，K2HPO41．0，瓊脂20，蒸餾水1 L，p H 7．0，121℃滅菌30 min．

染料培養(yǎng)基：添加染料的富集分離培養(yǎng)基．

2 方法

2．1 光合細(xì)菌的富集與分離

在無(wú)菌條件下，將采集的印染污泥和廢水以體積比1∶1混合，再與富集培養(yǎng)基按體積比1∶5混勻裝入三角瓶中，再加入配好的染料溶液，使染料最終質(zhì)量濃度達(dá)到0．4 mg／m L，并加入已滅菌的液體石蠟（高約2 cm）形成厭氧環(huán)境，放入光照培養(yǎng)箱中，28～30℃，3 000 lx，培養(yǎng)7～15 d，待液體培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色或紅棕色后，取適量的富集液移至新配制的富集培養(yǎng)基中，進(jìn)行2次富集培養(yǎng)（每換1次富集培養(yǎng)基，染料質(zhì)量濃度增加1倍），重復(fù)2～3次．

采用染料固體培養(yǎng)基稀釋涂布法和平板劃線法進(jìn)行分離，應(yīng)用焦性沒(méi)食子酸法除氧［10－11］，在28～30℃，光照厭氧培養(yǎng)7～10 d，分離篩選具有脫色能力的菌株，轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基備用．

2．2 菌株形態(tài)觀察

將分離得到的菌株轉(zhuǎn)接到未加染料的培養(yǎng)基上，在28～30℃，光照厭氧培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，進(jìn)行革蘭氏染色，鞭毛染色，菌體形態(tài)觀察．

2．3 菌體活細(xì)胞吸收光譜的測(cè)定

采用液體培養(yǎng)基，28～30℃，光照厭氧培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)物經(jīng)離心生理鹽水洗滌，將菌體懸浮于600 g／L的蔗糖溶液中，于UV 2802S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在300～1 000 nm連續(xù)掃描［12］．

2．4 脫色率和降解率測(cè)定

脫色率的測(cè)定［13］：取適量培養(yǎng)液經(jīng)5 000 r／min離心20 min后取上清液，以未加染料的液體培養(yǎng)基做空白，未接種菌體的染料培養(yǎng)基做對(duì)照，用722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)在染料最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度值，計(jì)算該菌的脫色率．

式中，A表示未接種染料培養(yǎng)基的最大吸光度，B表示脫色后染料培養(yǎng)液的最大吸光度，以脫色率表示該菌的脫色能力．

降解率的測(cè)定：用乙醇抽提法將菌體吸附的染料洗脫下來(lái)，以未加染料只加乙醇的培養(yǎng)基為空白，以染料培養(yǎng)基為對(duì)照，用722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)在染料最大吸收波長(zhǎng)測(cè)吸光度值，計(jì)算降解率．

式中，C表示加入等體積乙醇的未接種染料培養(yǎng)基的最大吸光光度值；D表示用乙醇洗脫后的培養(yǎng)液的最大吸光光度值．根據(jù)降解率大小來(lái)判斷菌株對(duì)染料的降解能力．

2．5 染料脫色后產(chǎn)物光譜分析

將培養(yǎng)液以5 000 r／min離心20 min取上層清液，以染料培養(yǎng)基為對(duì)照，不加染料的培養(yǎng)基為空白，利用UV 2802S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在300～700 nm掃描，對(duì)染料的降解產(chǎn)物進(jìn)行光譜分析．

2．6 p H、碳源和氮源對(duì)脫色效果的影響

在探索某因素對(duì)光合細(xì)菌脫色的影響時(shí)，采取單因素實(shí)驗(yàn)法，固定其他因素條件不變，在一定范圍內(nèi)改變?cè)撘蛩氐闹担?0℃，3 000 lx光照厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時(shí)間，以未接菌的染料培養(yǎng)基為對(duì)照，未加染料的培養(yǎng)基為空白，測(cè)定脫色率及降解率．

3 結(jié)果和討論

3．1 菌株形態(tài)

經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)，稀釋涂布法和劃線分離法得到一株具有脫色能力的菌株HL，其菌落呈鮮紅色，圓形、光滑、濕潤(rùn)、稍突起、邊緣整齊，直徑0．5～2．0 mm．革蘭氏染色為陰性，個(gè)體呈螺旋狀，單根極生鞭毛．

菌體活細(xì)胞吸收光譜測(cè)定，結(jié)果如圖1，在580，802，862 nm處都有吸收峰出現(xiàn)，與細(xì)菌葉綠素a的吸收波長(zhǎng)相符，由此可表明分離出的菌株HL含有細(xì)菌葉綠素a，可進(jìn)行光合作用，屬光合細(xì)菌．

圖1 HL菌株活細(xì)胞全波長(zhǎng)掃描圖譜Fig．1 Absorption spectrum of live cell suspension of strain HL

3．2 菌株HL對(duì)幾種染料的脫色效果

將菌株HL種子液，接種到質(zhì)量濃度為0．4 mg／m L的不同染料培養(yǎng)基中，光照厭氧培養(yǎng)24，48 h取樣測(cè)吸光度值，根據(jù)公式（1）計(jì)算脫色率，結(jié)果如表1．

由表1可知，菌株HL對(duì)以上5種染料都有脫色能力，其中對(duì)活性艷紅和直接胡蘭的脫色效果最顯著，特別是對(duì)直接胡蘭，在24 h內(nèi)脫色率達(dá)到100%，HL對(duì)活性艷蘭和直接翠蘭的脫色效果分別只有52．43%和42．40%，酸性黑的脫色效果為69．85%．

用乙醇抽提法將菌體吸附的染料洗脫下來(lái)，根據(jù)公式（2）計(jì)算降解率，結(jié)果如表2．

表1 HL菌株對(duì)幾種染料的脫色率Tab．1 Several dye decolorization rate of strain HL

表2 HL菌株對(duì)幾種染料的降解率Tab．2 Several dye degradation rate of strain HL

由表2可知，光合細(xì)菌HL對(duì)活性艷紅和直接胡蘭有脫色能力可能是HL菌株在脫色的過(guò)程中產(chǎn)生某種物質(zhì)與活性艷紅和直接胡蘭發(fā)生作用，改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其降解．反之，活性艷蘭和直接翠蘭的降解率分別只有19．43%和13．11%，可能是被菌株HL吸附，所以很容易被乙醇洗脫下來(lái)．

3．3 代謝產(chǎn)物光譜分析

由脫色前后全波長(zhǎng)掃描圖（圖2～5）可知，活性艷紅、直接胡蘭和酸性黑之所以能被菌株HL脫去顏色，是因?yàn)榫闔L在脫色過(guò)程中，破壞染料分子其原來(lái)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，本來(lái)在脫色前最大吸收波長(zhǎng)處有峰，但是脫色后吸收峰消失了，染料被降解了．直接翠蘭不管脫色前還是脫色后最大吸收波長(zhǎng)處都有吸收峰出現(xiàn)，根據(jù)圖5可得出結(jié)論，菌株HL之所以對(duì)直接翠蘭有脫色效果是吸附作用的結(jié)果．另一方面，染料被降解后可能會(huì)產(chǎn)生新的物質(zhì)，影響到脫色率和降解率測(cè)定的準(zhǔn)確性，將脫色前后的全波長(zhǎng)掃描圖與表1和表2相結(jié)合可以說(shuō)明染料被降解不會(huì)影響脫色率和降解率測(cè)定的結(jié)果．

圖2 活性艷紅脫色前、后的紫外－可見(jiàn)光譜Fig．2 Ultraviolet－visible spectrum of activity liquor before decolorization and after decolorization

圖3 直接胡蘭脫色前、后的紫外－可見(jiàn)光譜Fig．3 Ultraviolet－visible spectrum of directly Hulan before decolorization and after decolorization

圖4 酸性黑脫色前、后的紫外－可見(jiàn)光譜Fig．4 Ultraviolet－visible spectrum of acid black before decolorization and after decolorization

圖5 直接翠蘭脫色前、后的紫外－可見(jiàn)光譜Fig．5 Ultraviolet－visible spectrum of direct Cuilan before decolorization and after decolorization

3．4 p H、碳源和氮源對(duì)脫色效果的影響

3．4．1 p H對(duì)菌株脫色能力的影響

以直接胡蘭做脫色染料，將菌株HL轉(zhuǎn)接到不同p H的染料培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，同時(shí)以未接菌的染料培養(yǎng)基為對(duì)照，未接種的培養(yǎng)基為空白，測(cè)定脫色率和降解率的結(jié)果見(jiàn)圖6．

圖6 p H對(duì)菌株HL脫色能力的影響Fig．6 Effect of initial p H on decolorization

由圖6可知，菌株HL在p H＜4時(shí)對(duì)直接胡蘭的脫色效果不明顯．在p H 7時(shí)，菌株HL脫色率和降解率都很高，分別是91．34%和94．69%，而且隨著p H的增大或減小，菌株對(duì)染料的脫色率和降解率也隨之下降．由此表明，光合細(xì)菌HL在p H 7時(shí)，其對(duì)直接胡蘭的脫色效果最好．

3．4．2 氮源對(duì)菌株脫色能力的影響

以直接胡蘭做脫色染料，將菌株HL轉(zhuǎn)接到不同氮源的染料培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，測(cè)定脫色率和降解率的結(jié)果如表3所示．3種替代氮源都可以被菌株HL利用，各種氮源對(duì)脫色率和降解率的影響為：氯化銨＞蛋白胨＞尿素＞硝酸鈉．由此可知，菌株HL以氯化銨作為氮源對(duì)染料的脫色率和降解率最優(yōu)，確定無(wú)機(jī)氮源氯化銨為菌體生長(zhǎng)及脫色降解染料的最適氮源．

3．4．3 碳源對(duì)菌株脫色能力的影響

以直接胡蘭做脫色染料，將菌株HL轉(zhuǎn)接到不同碳源的染料培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，同時(shí)以未接菌的染料培養(yǎng)基為對(duì)照，未接種的培養(yǎng)基為空白，測(cè)定脫色率和降解率的結(jié)果如表3．葡萄糖、甘露醇和醋酸鈉很容易被光合細(xì)菌HL利用，丁二酸鈉很難被菌體利用，所以菌體很難生長(zhǎng)導(dǎo)致脫色率和降解率都很低．各種碳源對(duì)脫色率和降解率的影響為：葡萄糖＞甘露醇＞醋酸鈉＞丁二酸鈉．由此可知，菌株HL以葡萄糖作為碳源對(duì)染料進(jìn)行脫色時(shí)測(cè)得的脫色率和降解率最優(yōu)，說(shuō)明這4種碳源中葡萄糖最容易被菌體HL利用．

表3 氮源、碳源對(duì)脫色率和降解率的影響Tab．3 Effect of different nitrogen and carbon sources on decolorization rate and degradation rate

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)篩選出1株光合細(xì)菌HL，其菌落呈鮮紅色，革蘭氏染色為陰性，菌體為螺旋狀，含有細(xì)菌葉綠素a．

菌株HL對(duì)活性艷紅和直接胡蘭的脫色效果顯著，特別是對(duì)直接胡蘭的脫色能力在24 h內(nèi)達(dá)到100%，是一株對(duì)直接胡蘭具有高效脫色能力的光合細(xì)菌．

菌株HL的脫色能力與生長(zhǎng)同步，在中性環(huán)境下，分別以葡萄糖和氯化銨作為脫色培養(yǎng)基的碳源和氮源時(shí)，對(duì)直接胡蘭的脫色率和降解率分別達(dá)到100%和98．67%．

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（責(zé)任編輯：趙藏賞）

Separation and analysis of photosynthetic bacteria of high efficiency decolorization

LI Yan－qin，CHANG Yan－ping，LI Chun－qing，CHEN Han－xi，KANG Xian－jiang
（College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China）

In order to enhance the biological treatment of dyestuff wastewater，a strain HL of photosynthetic bacteria with high efficiency on the dye decoloring ability were separated and analyzed．The effects of the strain HL on decolourization of five dyes under different conditions such as the choice of p H，carbon source and nitrogen source were studied．Results showed that the strain HL colony was bright red，circular，moist，smooth，slightly protuberant，edge tidy，diameter 0．5－2．0 mm，individual assume spiral－shaped，single extremely born flagellum，gram's staining for negative，contain bacteria chlorophyll－a for photosynthesis．And the decoloring ability were determined on the five types of dye，including on the active liquor and direct Hulan of decolorization optimal，especially for the treatment of ability within 24 h on direct Hulan was 100%．Strain HL in a neutral environment，respectively with glucose and ammonium chloride as decoloring medium carbon source and nitrogen source，the decolored rate and degradation rate of direct Hulan were 100%and 98．67%respectively．

photosynthetic bacteria；printing and dyeing wastewater；decolorization rate；degradation rate

Q939．9

A

1000－1565（2012）04－0399－07

2011－09－26

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（C2011201028）

李彥芹（1965－），女，河北滿(mǎn)城人，河北大學(xué)副教授，主要從事微生物和免疫學(xué)研究．E－mail：Liyanqin88＠yahoo．com．cn