苦丁茶紫外圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法

龐濤濤 (山西師范大學(xué)分析測(cè)試中心， 山西 臨汾 041004)

張緒言 (山西華潤(rùn)煤業(yè)有限公司，山西 太原 030001)

苦丁茶紫外圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法

龐濤濤 (山西師范大學(xué)分析測(cè)試中心， 山西 臨汾 041004)

張緒言 (山西華潤(rùn)煤業(yè)有限公司，山西 太原 030001)

用3種溶劑氯仿、無(wú)水乙醇及水，系統(tǒng)提取苦丁茶等不同極性區(qū)間成分，測(cè)定其紫外圖譜，研究樣品的異同，采用圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法分析苦丁茶紫外圖譜。結(jié)果表明：該方法可以準(zhǔn)確地區(qū)分不同產(chǎn)地和不同級(jí)別的苦丁茶。利用共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法可以對(duì)2個(gè)或多個(gè)樣品進(jìn)行方便可靠的鑒別，是一種符合中藥自身特點(diǎn)的光譜指紋圖譜分析方法。

苦丁茶；雙指標(biāo)法；共有峰率；變異峰率；序列分析

苦丁茶系冬青科植物大葉冬青(llexlatifoliaThunb)的干燥葉，是我國(guó)南部和西南部民間常用的藥用植物,具有散風(fēng)熱、清頭目、除煩渴、止頭疼等功效?？喽〔柙谖覈?guó)分布較廣，不同的產(chǎn)地其品質(zhì)各異。因此建立一種快速、準(zhǔn)確的鑒別苦丁茶的方法，對(duì)苦丁茶的質(zhì)量監(jiān)控具有十分重要的意義。

各種現(xiàn)代儀器已廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制研究中，其中光譜分析由于其操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，測(cè)試速度快和測(cè)試成本低而被廣泛應(yīng)用。紫外圖譜分析采用間隔一定波長(zhǎng)取測(cè)量數(shù)據(jù)，建立大的數(shù)據(jù)集，進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析[1-3]，可以對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行準(zhǔn)確的分類，考慮到生物樣品各類成分之間的非對(duì)稱性關(guān)系,根據(jù)藥材自身具有遺傳穩(wěn)定性和變異性的生物學(xué)特點(diǎn),建立了共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法。用該法可以對(duì)不同中藥樣品做出定量且細(xì)致的區(qū)別,可以對(duì)至少2個(gè)樣品進(jìn)行定量鑒別。研究發(fā)現(xiàn),與紅外指紋圖譜[4-8]、HPLC 指紋圖譜[9]比較,中藥紫外指紋圖譜有著最好的穩(wěn)定性及重復(fù)性。

本研究采用3種溶劑系統(tǒng)提取中藥不同極性區(qū)間的成分，分別測(cè)定它們的指紋圖譜，可以給出十幾個(gè)特征吸收峰數(shù)據(jù)。借助于紫外光譜[10]用共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列法研究了不同產(chǎn)地、不同級(jí)別苦丁茶的紫外圖譜，結(jié)果表明該方法可以較好地鑒別不同產(chǎn)地及不同級(jí)別的苦丁茶。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

UV-2201型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津)、KH-250B型超聲波清洗器、無(wú)水乙醇(分析純)、氯仿(分析純)、二次蒸餾水。測(cè)試樣品來(lái)源于浙江、海南(二級(jí)，一級(jí)，特級(jí))、四川(特級(jí)，一級(jí)，特級(jí))、云南、廣西(一級(jí)，特級(jí))、廣東6個(gè)產(chǎn)地共11種苦丁茶，編號(hào)依次為K1～K11。

1.2 測(cè)試樣品制備及測(cè)試條件

樣品加入各種提取溶劑，分別在室溫下采用超聲方法提取45min可達(dá)到最大且穩(wěn)定的提取率。測(cè)定波長(zhǎng)200～600nm，狹縫2.0nm，采樣間隔0.2nm。

1.3 紫外指紋圖譜測(cè)試液制備

將藥材粉末過(guò)100目篩,精密稱取0.250g，置于具塞50ml錐形瓶中，精密加入20ml氯仿，超聲提取45min，過(guò)濾，用氯仿洗滌，收集洗滌液，定容至25ml，作為待測(cè)液，揮干樣品所帶氯仿，加入20ml無(wú)水乙醇，超聲提取45min，過(guò)濾、洗滌得25ml無(wú)水乙醇提取液，水提取液方法同。氯仿測(cè)定原液或稀釋1～2倍，無(wú)水乙醇提取液稀釋5倍，水提取液稀釋10倍(使最大光密度Dlt;2或接近2)，以對(duì)應(yīng)的溶劑為參比溶液進(jìn)行紫外圖譜測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外指紋圖譜共有峰的確定

表1 苦丁茶氯仿、無(wú)水乙醇和水提取液紫外指紋圖譜共有吸收峰波長(zhǎng) nm

對(duì)于紫外光譜圖譜，可采用中藥指紋圖譜共有峰的理論識(shí)別方法W正態(tài)分布檢驗(yàn)判別法，對(duì)各種共有峰進(jìn)行識(shí)別。而對(duì)于一組非常接近的吸收峰，它們相差很小，但不滿足正態(tài)分布，可采用如下方法確定共有峰：對(duì)于一組吸收峰，若組內(nèi)吸收峰波長(zhǎng)的最大差異顯著小于該組與相鄰組之間的平均波數(shù)差，就確定該組峰是一組共有峰。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2苦丁茶紫外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列

共性鑒別指標(biāo)：(1)共有峰率P=(共有峰數(shù)Ng/2個(gè)UV圖中的獨(dú)立峰數(shù)Nd)·100%。(2)共有峰數(shù)Ng：指在比較的2個(gè)UV圖中都出現(xiàn)的吸收峰的個(gè)數(shù)。(3)獨(dú)立峰：紫外圖譜中不同的吸收峰。na：圖譜a中相對(duì)與其共有峰的非共有峰數(shù)，稱為a的變異峰數(shù)。nb：圖譜中b相對(duì)與其共有峰的非共有峰數(shù)，稱為b的變異峰數(shù)。(4)獨(dú)立峰數(shù)Nd：相互比較的2個(gè)UV圖中的獨(dú)立峰總數(shù)Nd=Ng+na+nb。

變異鑒別指標(biāo)：變異峰率Pv：一個(gè)圖譜的變異峰率Pv是該UV圖中相對(duì)于共有峰的變異峰數(shù)與其共有峰數(shù)的比值Pva= (na/Ng)·100%。Pva：圖譜a的變異峰率；Pvb= (nb/Ng)·100%。Pvb：圖譜b的變異峰率。

11個(gè)苦丁茶樣品的雙指標(biāo)序列如下：

K1:K9K10(60.00;50.0,16.7) K4(54.5;50.0,33.3) K8K11(50.00;80.0,20.0) K2K3(45.5;80.0,40.0) K5K7(35.7;80.0,100.0) K6(26.7;125.0,150.0)

K2:K4(87.5;0,14.3) K3(75.0;16.7,16.7) K1(45.5;40.0,80.0) K8(44.4;75.0,50.0) K5K7(41.7;40.0,100.0) K10(40.0;75.0,75.0) K6(30.8;75.0,150.0) K9(27.3;133.3,133.3) K11(25.0;200.0,100.0)

K3:K4(87.5;0,14.3) K2(75.0;16.7,16.7) K1(45.5;40.0,80.0) K8(44.4;75.0,50.0) K5K6K7(41.7;40.0,100.0) K10(40.0;75.0,75.0) K11(30.0;133.3,100.0) K9(27.3;133.3,133.3)

K4:K2K3(87.5;14.3,0) K8(55.6;60.0,20.0) K1(54.5;33.3,50.0) K5K7(50.0;33.3,66.7) K11(40.0;100.0,50.0) K6(38.5;60.0,100.0) K9K10(36.4;100.0,75.0)

K5:K6K7(81.8;11.1,11.1) K4(50.0;66.7,33.3) K8K11(45.5;100.0,20.0) K2K3K9K10(41.7;100.0,40.0) K1(35.7;100.0,80.0)

K6:K5K7(81.8;11.1,11.1) K3(41.7;100.0,40.0) K4(38.5;100.0,60.0) K8K11(33.3;150.0,50.0) K2K9K10(30.8;150.0,75.0) K1(26.7;150.0,125.0)

K7:K5K6(81.8;11.1,11.1) K4(50.0;66.7,33.3) K8K11(45.5;100.0,20.0) K2K3K9K10(41.7;100.0,40.0) K1(35.7;100.0,80.0)

K8:K11(71.4;20.0,20.0) K9K11(62.5;20.0,40.0) K4(55.6;20.0,60.0) K1(50.0;20.0,80.0) K5K7(45.5;20.0,100.0) K2K3(44.4;50.0,75.0) K6(33.3;50.0,150.0)

K9:K10(85.7;16.7,0) K11(75.0;16.7,16.7) K8(62.5;40.0,20.0) K1(60.0;16.7,50.0) K5K7(41.7;40.0,100.0) K4(36.4;75.0,100.0) K6(30.8;75.0,150.0) K2K3(27.3;133.3,133.3)

K10:K9(85.7;16.7,0) K11(75.0;16.7,16.7) K8(62.5;40.0,20.0) K1(60.0;16.7,50.0) K5K7(41.7;40.0,100.0) K2K3(40.0;75.0,75.0) K4(36.4;75.0,100.0) K6(30.8;75.0,150.0)

K11:K9K10(75.0;16.7,16.7) K8(71.4;20.0,20.0) K1(50.0;20.0,80.0) K5K7(45.5;20.0,100.0) K4(40.0;50.0,100.0) K6(33.3;50.0,150.0) K3(30.0;100.0,133.3) K2(25.0;100.0,20.0)

*K9:K10(85.7;16.7,0)表示該序列以K9為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算其他樣品圖譜的共有峰率和變異峰率，該序列片斷表示K9和K10的共有峰率是85.7，其中K9的變異峰率為16.7，K10的變異峰率為0，K7:K5K6(81.8;11.1,11.1)表示K5K6與K7的共有峰率相等，為81.8，K5K6與K7具有相同的變異峰率11.1。

由上述序列可知，在不同的序列中，不同樣品的共有峰率不同，樣品之間的關(guān)系一般不同。利用該n維雙指標(biāo)序列空間可以方便地找到某一樣品的最相近樣品，從而可以避免在單一序列空間中比較不同樣品。從上述序列看，該分析方法得到的結(jié)論可靠。

因此，利用n個(gè)樣品為標(biāo)準(zhǔn)建立n維共有峰率和變異峰率序列空間，可以更合理地建立不同樣品之間最直接的相似性聯(lián)系，得到更合理的鑒別結(jié)論。與某一樣品具有相同共有峰率的樣品，往往具有不同的變異峰率，或者與某一樣品具有相同變異峰率的樣品，往往具有不同的共有峰率，因而雙指標(biāo)指紋圖譜分析方法較單指標(biāo)分析法具有更高的分辨率，利用雙指標(biāo)分析法可以對(duì)樣品進(jìn)行更深層次的區(qū)分及認(rèn)同。如：K2:K8(44.4;75.0,50.0) K10(40.0;75.0,75.0) K6(30.8;75.0,150.0)中K2與K8K10K6具有相同的變異峰率，但K2和K8、K10與K6的共有峰率不同，分別是44.4、40.0與30.8，可以更好地做出區(qū)分。K3:K5K6K7(41.7;40.0,100.0)中K5K6K7與K3具有相同的共有峰率及變異峰率，說(shuō)明K5K6K7三者相對(duì)于K3，它們確實(shí)非常相似。

2.3 11種苦丁茶的基本關(guān)系組、對(duì)及分析

A:K2:K4(87.5;0,14.3) K3(75.0;16.7,16.7),K3:K4(87.5;0,14.3) K2(75.0;16.7,16.7),K4:K2K3(87.5;14.3,0)

在A組中上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：K2、K3、K4海南3種苦丁茶關(guān)系最近，且相似程度最高。

B:K1:K8K11(50.00;80.0,20.0),K5:K8K11(45.5;100.0,20.0),K6:K8K11(33.3;150.0,50.0),K7:K8K11(45.5;100.0,20.0)

在B組中，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：相對(duì)于浙江和四川苦丁茶而言，云南和廣東苦丁茶共有峰率一樣，即在不同產(chǎn)地的苦丁茶中，云南和廣東苦丁茶相似程度最大。

C:K2:K10(40.0;75.0,75.0) K9(27.3;133.3,133.3) K3:K10(40.0;75.0,75.0) K9(27.3;133.3,133.3)

K11:K4(40.0;50.0,100.0) K3(30.0;100.0,133.3) K2(25.0;100.0,20.0)

相對(duì)于海南一級(jí)和二級(jí)苦丁茶而言，廣西兩種級(jí)別苦丁茶共有峰率大小順序?yàn)椋篕10gt;K9，即：特級(jí)gt;一級(jí)。相對(duì)于廣東苦丁茶而言，海南3種級(jí)別苦丁茶共有峰率大小順序?yàn)镵4gt;K3gt;K2，即：特級(jí)gt;一級(jí)gt;二級(jí)。由11種苦丁茶的雙指標(biāo)序列可以看出：對(duì)于同一產(chǎn)地的苦丁茶來(lái)說(shuō)，相對(duì)于任何一種苦丁茶來(lái)說(shuō)，K5K7gt;K6，即：四川特級(jí)gt;四川一級(jí)。因此，利用共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法，可以對(duì)上述11種苦丁茶給出符合實(shí)際情況的鑒別結(jié)論。

從變異峰率看，不同產(chǎn)地的苦丁茶之間的變異峰率最大，如：K1:K6(26.7;125.0,150.0)。同一產(chǎn)地不同級(jí)別的苦丁茶之間的變異峰率較小，如：K2:K3(75.0;16.7,16.7)。而同一產(chǎn)地級(jí)別相同的苦丁茶之間的變異峰率最小，如：K2:K4(87.5;0,14.3)，這正確的反映了實(shí)際情況。

上述分析表明，不同產(chǎn)地，同一產(chǎn)地不同級(jí)別及同一級(jí)別之間均存在著明顯的差異。從多維共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法可以得到更多的信息，對(duì)不同產(chǎn)地、不同級(jí)別具有準(zhǔn)確、精細(xì)且非常直觀的鑒別能力。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，氯仿、無(wú)水乙醇和水3種溶劑紫外圖譜吸收峰的共性和差異可以用多維共有峰率和變異峰率序列以數(shù)量精確地表示出來(lái)，因而三溶劑紫外圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法是一種新的精確鑒別中藥的方法。

[1]Liu Hongxia,Zhou Qun,Sun Suqin,et al.Discrimination of different chrysanthemums with fourier transform infrared spectroscopy[J].J Mol Struct,2008,883-884:38-47.

[2]PEIL ikuan,SUN Suqin,GUO Baolin,et al.Fast quality control of herb aepimedii by using fourier transform infrared spectroscopy[J].Spectrochim Acta Part A,2008,70:258-264.

[3]QU IRINO J P,TERABE S.Approaching amillion-fold sensitivity increase incapillary electropho resis with direct ultraviolet detection:Cation-selective exhaustive injection and sweeping[J].Anal Chem,2000,72:1023-1030

[4]倪力軍,李 鵬,鄭 榮,等.丹參提取物紅外指紋圖譜間相似度的定量分析[J].中成藥,2002,24(2):79-82.

[5]鄒華彬，袁久榮，杜愛(ài)琴,等.甘草水提物紅外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法[J].中成藥,2004,26 (10):779-783.

[6]龐濤濤,杜黎明.苦丁茶紅外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法[J].光譜學(xué)與光譜分,2007,27(3):486-489.

[7]龐濤濤,杜黎明.紅外光譜法直接鑒別苦丁茶的研究[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2007,(2) :213-215.

[8]龐濤濤,杜黎明.人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類鑒別苦丁茶紅外光譜[J].光譜學(xué)與光譜分析,2007,(7):1336-1339.

[9]鄒華彬，袁久榮，袁 浩.秘魯產(chǎn)人參保健品HPLC和四維UV指紋圖譜研究[J].中成藥,2003,25 (4):261-265.

[10]鄒華彬,袁 浩,王愛(ài)武 ,等.白芍紫外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析[J].光譜學(xué)與光譜分析,2007,27(9):1815-1819.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.01.010

O657.32

A

1673-1409(2012)01-S035-03

2011-12-10

龐濤濤(1980-),女,山西文水人,博士生,研究方向?yàn)樗幬锓治觥?/p>