熒光分光光度法測定福建野生金線蓮中總黃酮含量

吳水華

（福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥系，福建 福州 350002）

熒光分光光度法測定福建野生金線蓮中總黃酮含量

吳水華*

（福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥系，福建 福州 350002）

目的：根據(jù)黃酮類化合物與Al3＋形成穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物原理，建立一種準(zhǔn)確測定金線蓮中總黃酮的方法。方法：采用超聲提取法用95%乙醇提取福建野生金線蓮中的總黃酮，以槲皮素為對照品，用熒光分光光度法測定總黃酮的含量，并進(jìn)行回收率試驗(yàn)。結(jié)果：在選定的條件下，槲皮素濃度與熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)，線性范圍2～400 ng·mL－1，檢出限為0.4 ng·mL－1，線性方程Y＝2 098.1X＋4.167 8，r＝0.999 8，平均回收率為98.4%，RSD＝1.5%。結(jié)論：本法操作簡便、快速、準(zhǔn)確，適用于金線蓮中總黃酮的含量測定。

金線蓮；熒光法；總黃酮

金線蓮Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.，別名金蠶、金石松、樹草蓮、鳥人參、金線虎頭蕉、金線入骨消，是蘭科開唇蘭屬的植物［1］。金線蓮在降血糖［2］、降血壓［3］、保肝護(hù)肝［4］等方面具有顯著的藥理作用，是閩南民間常用要藥。金線蓮中含有多糖、黃酮、揮發(fā)油等多種成分，其中黃酮類化合物主要由槲皮素、異鼠李素及其糖苷組成［5-9］。目前，有關(guān)總黃酮的含量測定國內(nèi)外沒有公開的標(biāo)準(zhǔn)方法，《中國藥典》中收載較多的是可見－紫外分光光度法，通常選用蘆丁作為對照品，此法操作簡便，但雜質(zhì)干擾大，測定誤差較大。近年來，熒光分光光度法測定總黃酮含量具有簡便、快速、專屬性好等特點(diǎn)，得到了眾多學(xué)者的關(guān)注。目前，對金線蓮中的總黃酮的測定，尚未見有應(yīng)用熒光法的文獻(xiàn)報(bào)道。本文根據(jù)文獻(xiàn)［10］選用槲皮素作為對照品，采用熒光法對福建野生金線蓮中的總黃酮含量進(jìn)行測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)（美國瓦里安）；AL204型萬分之一分析電子天平［梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司］；AKRY-UP-Ⅲ-10艾柯超純水機(jī)（成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠）；KQ-100B超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。所用玻璃儀器均用重鉻酸鉀洗液浸泡24 h后用自來水沖洗干凈，并用超純?nèi)ルx子水充分沖洗干凈。

1.2 試劑與藥材

槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，97.4%）；冰醋酸（AR，江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司）；石油醚（60～90℃）、95%乙醇（AR，天津市巴斯夫化工有限公司）；結(jié)晶氯化鋁（AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；所用蒸餾水均為超純?nèi)ルx子水。

野生金線蓮，采自福建德化地區(qū)，由福建農(nóng)林大學(xué)張大鵬教授鑒定為蘭科開唇蘭屬植物花葉開唇蘭Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.，干燥后粉碎過2號篩。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 槲皮素對照品溶液制備 精密稱取槲皮素對照品10 mg，置于小燒杯中，用少量95%乙醇溶解，并轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL－1的槲皮素對照品溶液。

2.1.2 樣品溶液制備 精密稱取福建野生金線蓮藥粉0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入石油醚20 mL浸泡24 h，濾除石油醚，藥渣揮干，加入10 mL 95%乙醇超聲處理0.5 h，共3次，濾液并入50 mL容量瓶，并用95%乙醇定容至刻度，搖勻。

2.1.3 試劑溶液制備 醋酸溶液：精密移取1.43 mL冰醋酸置50 mL容量瓶中，用95%乙醇稀釋定容至刻度，搖勻，制得0.5 mol·L－1的醋酸乙醇溶液，備用。

三氯化鋁溶液：精密稱取0.912 2 g AlCl3·6H2O置小燒杯中，用95%乙醇溶解，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，稀釋定容至刻度，搖勻，制得10 mg·mL－1的三氯化鋁乙醇溶液，備用。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件選擇

2.2.1 測定波長選擇 分別取槲皮素對照溶液及樣品溶液適量，加入適量醋酸及三氯化鋁顯色后進(jìn)行激發(fā)和發(fā)射光譜掃描，所得譜圖如圖1所示。由圖1可知，試劑空白溶液在此條件下對實(shí)驗(yàn)結(jié)果無干擾，槲皮素和樣品溶液在酸性條件下都與三氯化鋁絡(luò)合反應(yīng)產(chǎn)生熒光物質(zhì)，各自的激發(fā)波長分別為λex＝435 nm和λex＝433 nm，發(fā)射波長為λex＝485 nm和λex＝479 nm。本實(shí)驗(yàn)選擇測定熒光條件為：激發(fā)波長435 nm，發(fā)射波長485 nm，狹縫寬度為5 nm。

圖1 熒光光譜

2.2.2 體系醋酸加入量 在槲皮素、三氯化鋁的條件不變的情況下，考察了體系中不同醋酸濃度對熒光強(qiáng)度的影響，見圖2所示。由圖2可知，在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)體系中醋酸的摩爾濃度較低時，隨醋酸摩爾濃度的增大，它們的熒光強(qiáng)度迅速增加，當(dāng)加入醋酸的摩爾濃度達(dá)到0.05 mol·L－1時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，然后隨著醋酸摩爾濃度的增大，熒光強(qiáng)度降低，所以本實(shí)驗(yàn)確定加入醋酸的量使體系的醋酸濃度達(dá)到 0.05 mol·L－1。

圖2 醋酸濃度的影響

2.2.3 體系三氯化鋁加入量 在固定體系槲皮素、醋酸的濃度的情況下，考察了體系中不同三氯化鋁濃度對熒光強(qiáng)度的影響，見圖3所示。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)體系中三氯化鋁的質(zhì)量濃度較低時，隨三氯化鋁濃度的增大，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，當(dāng)加入三氯化鋁的質(zhì)量濃度在0.6～0.7mg·mL－1時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值（RSD＝0.5%），然后隨著三氯化鋁質(zhì)量濃度的增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度緩慢降低。本實(shí)驗(yàn)選擇加入三氯化鋁的量為使體系中三氯化鋁的濃度為0.6 mg·mL－1。

圖3 三氯化鋁濃度的影響

2.2.4 乙醇量對熒光強(qiáng)度的影響 在槲皮素、醋酸和三氯化鋁的條件不變的情況下，考察了不同容量百分?jǐn)?shù)的乙醇對熒光強(qiáng)度的影響，見圖4所示。由圖4可知，乙醇的容量百分?jǐn)?shù)對熒光強(qiáng)度的影響比較大，乙醇的容量百分?jǐn)?shù)越高，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，所以本實(shí)驗(yàn)選擇95%的乙醇為溶劑。

圖4 乙醇濃度的影響

2.2.5 試劑加入順序影響 在其余條件固定的條件下，按實(shí)驗(yàn)方法考察了試劑加入順序?qū)晒鈴?qiáng)度的影響，結(jié)果表明：分別按槲皮素＋醋酸＋三氯化鋁、三氯化鋁＋醋酸＋槲皮素、醋酸＋槲皮素＋三氯化鋁的順序加入，三者熒光強(qiáng)度均較強(qiáng)，無顯著差別（RSD＝1.0%），而其余組合順序的熒光強(qiáng)度均比較弱。本實(shí)驗(yàn)選擇按槲皮素＋醋酸＋三氯化鋁的順序加入。

2.2.6 體系穩(wěn)定性 槲皮素和樣品溶液熒光體系在不同測定時間內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化情況見圖5。由圖5可知，二者熒光強(qiáng)度開始時迅速增強(qiáng)，5～15 min達(dá)到穩(wěn)定，而后隨著時間的延長，熒光強(qiáng)度平緩下降，故顯色后5～15 min為最佳測定時間，本實(shí)驗(yàn)選擇顯色10 min時測定。

圖5 放置時間影響

2.3 測定方法

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取1 mL槲皮素對照品溶液，置于50 mL容量瓶中，用95%乙醇稀釋定容至刻度，搖勻。精密移取不同體積的上述槲皮素溶液置于10 mL的容量瓶中，依次加入0.5 mol·L－1的醋酸乙醇溶液1 mL，10 mg·mL－1三氯化鋁乙醇溶液0.6 mL，用95%的乙醇水溶液稀釋定容至刻度，室溫放置10 min，在激發(fā)波長435 nm，發(fā)射波長485 nm，狹縫寬度為5 nm的條件下測定熒光強(qiáng)度（Y），并對相應(yīng)的濃度（X）繪制工作曲線，用最小二乘法求算出回歸方程（Y＝2 098.1X＋4.167 8）。

2.3.2 回收率試驗(yàn) 為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，采取加樣回收法進(jìn)行了回收率試驗(yàn)。精密稱取已知含量的供試品0.5 g，制備供試品溶液，加入0.1 mg·mL－1槲皮素對照品溶液0.7 mL，按上述最佳實(shí)驗(yàn)條件測定熒光強(qiáng)度，并根據(jù)回歸方程求算出樣品中總黃酮的濃度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.3.3 樣品含量測定 精密移取1 mL樣品溶液置于10 mL容量瓶中，按上述最佳實(shí)驗(yàn)條件測定熒光強(qiáng)度，并根據(jù)回歸方程求算出樣品中總黃酮的濃度，最后算出含量，見表2。

表2 野生金線蓮中總黃酮含量測定

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果

根據(jù)黃酮類化合物能與鋁離子形成穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物的原理，采用石油醚浸泡除去葉綠素后，用95%乙醇超聲提取臺灣金線蓮中的總黃酮，以槲皮素為對照品，用熒光分光光度法測定總黃酮的含量，在選定的條件下，槲皮素濃度與熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)，金線蓮中總黃酮的含量測得為139.4μg·g－1。

3.2 討論

金線蓮全草中含有大量的葉綠素，干擾測定，直接提取測定會使結(jié)果偏高，本文采用石油醚浸泡除去葉綠素，消除干擾，并考察了體系中醋酸濃度、三氯化鋁用量、溶劑、試劑加入順序、放置時間對熒光強(qiáng)度的影響，確定最佳的測定條件，進(jìn)一步提高了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。與三價鋁離子絡(luò)合產(chǎn)生熒光絡(luò)合物必須具備3-羥基，4-羰基、5-羥基，4-羰基或鄰二酚羥基的結(jié)構(gòu)，根據(jù)查閱相關(guān)金線蓮化學(xué)成分的報(bào)道文獻(xiàn)［5-9］，除了阿魏酸外，尚未在金線蓮中發(fā)現(xiàn)有非黃酮類的多酚物質(zhì)，而阿魏酸不具備上述結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對本測定方法不會產(chǎn)生干擾。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本法操作簡便、快速，測定準(zhǔn)確、可靠、靈敏，檢出限比UV法及HPLC法低了兩個數(shù)量級，適用于福建野生金線蓮中總黃酮的測定，為進(jìn)一步正確制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及開發(fā)利用提供依據(jù)。

［1］孔祥海.“藥王”金線蓮的自然資源初步研究［J］.中草藥，2001，32（2）：155-157.

［2］陳卓，黃自強(qiáng).金線蓮及其提取物降血糖實(shí)驗(yàn)研究［J］.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，34（4）：350-352.

［3］李葆華，陳以旺.金線蓮提取物ARL對腎血管性高血壓大鼠血壓、血漿血管緊張素Ⅱ、一氧化氮和內(nèi)皮素的影響［J］.中國分子心臟病學(xué)雜志，2006，6（3）：132-135.

［4］黃立峰，盧若艷，蘇志敏，等.福建金線蓮提取物對CCl4所致小鼠急慢性肝損傷的保護(hù)作用［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23（4）：278-281.

［5］何春年，王春蘭，郭順星，等.福建金線蓮的化學(xué)成分研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2005，40（8）：581-583.

［6］何春年，王春蘭，郭順星，等.福建金線蓮的化學(xué)成分研究Ⅱ［J］.中國中藥雜志，2005，30（10）：761-763.

［7］關(guān)璟，王春蘭，郭順星.福建產(chǎn)金線蓮中黃酮苷成分的研究［J］.中草藥，2005，36（10）：1450-1453.

［8］楊秀偉，韓美華，靳彥平.金線蓮化學(xué)成分的研究［J］.中藥材，2007，30（7）：797-800.

［9］何春年，王春蘭，郭順星，等.福建金線蓮的化學(xué)成分研究Ⅲ［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17（3）：259-262.

［10］郭玉梅，楊景和，吳霞.銀杏葉提取物中總黃酮含量的分析方法研究［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2009，44（5）：40-44.

Determ ination of Total Flavanoid in W ild Anoectochilus roxburghii（W all.）Lind l.from Fujian by Spectrofluorometry

WU Shui-hua
（Fujian Biological Engineering Vocational College，F(xiàn)uzhou350002，China）

Objective：Themethod of determining total flavanoid in wildAnoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.based on thereaction of flavanoid and alumimum（Ⅲ）.M ethods：The total flavanoid extracted from the samples with 95%ethanol under sonication.The content was measured by spectrofluorometry with quecetin as control.The recovery was also studied.Results：On the optimal conditions，the fluorescence intensity variations showed a linear relationshi Pwith the concentration of quercetin at2～400 ng·mL－1.Detection limitwas0.4 ng·mL－1（signal-to-noise ratio of3，n＝11）.The linear regression equation wasY＝2 098.1X＋4.167 8（r＝0.999 8），the recovery of 98.4% （RSD＝1.5%）.Conclusion：The proposed method，which is suitable for themeasurement of the total flavanoid in wildAnoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl，is simple，rapid and reliable.

Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.；Spectrofluorometry；Total flavanoid

*［通訊作者］吳水華，E-mail：lwshpw＠sina.com

2012-03-07）