火絨草抑菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究△

姜鴻，單國順，齊越，趙玥，尤獻(xiàn)民

（遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034）

中藥科技

火絨草抑菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究△

姜鴻*，單國順，齊越，趙玥，尤獻(xiàn)民

（遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034）

目的：探討中藥材火絨草抑菌作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析方法，以36個(gè)色譜峰的相對(duì)峰面積為自變量，提取物的抑菌圈直徑為因變量進(jìn)行相關(guān)性分析和回歸分析。結(jié)果得到36個(gè)色譜峰的相關(guān)系數(shù)。結(jié)論：初步確定火絨草中與16個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)組分具有抑菌活性，其中色譜峰X10為原兒茶酸，X13為原兒茶醛，X14為綠原酸，X16為咖啡酸。

火絨草；物質(zhì)基礎(chǔ)；相關(guān)分析；回歸分析；抑菌作用

火絨草Leontopodium leontopodioides（Willd.）Beauv.為菊科火絨草屬植物的干燥全草，味微苦，性寒；入腎、膀胱二經(jīng)；具有清熱涼血，消炎利腎的功效。對(duì)流行性感冒，急、慢性腎炎，尿路感染，尿血，創(chuàng)傷出血等癥狀有一定的療效。火絨草具有抑菌作用已有報(bào)道［1］，但是其抑菌活性成分的研究未見報(bào)道。

本研究利用極性萃取法將火絨草提取液分成不同極性化學(xué)組分，對(duì)其不同化學(xué)組分進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，并與各提取物指紋圖譜相對(duì)峰面積相關(guān)聯(lián)，使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性和回歸分析，初步確定火絨草中的抑菌活性物質(zhì)，為火絨草抑菌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試藥

Agilent1100高效液相色譜分析儀：四元泵、DAD檢測(cè)器、全自動(dòng)進(jìn)樣器Agilent公司。電熱恒溫培養(yǎng)箱（廈門醫(yī)療電子儀器廠）；電子數(shù)顯卡尺（桂林廣陸數(shù)字測(cè)控股份有限公司）。

1.2 材料

原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、咖啡酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110809-200604， 110810-200506， 110753-200413， 110885-200102）；乙腈、磷酸為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純；火絨草藥材采自沈陽東陵祝家地區(qū)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室王冰教授鑒定為火絨草Leontopodium leontopodioides（Willd.）Beauv.。

MH（Mueller-Hinton）瓊脂培養(yǎng)基，血瓊脂培養(yǎng)基（溫州市康泰生物科技有限公司）。金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、痢疾志賀菌、白色念珠菌（遼寧省臨床檢驗(yàn)中心）。

提取物制備：取火絨草藥材1 000 g，去雜質(zhì)，加18 000 mL水提取2次，每次1 h，量取1／2倍體積的提取液，減壓干燥；剩余提取液置分液漏斗中，分別用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇各萃取3次，合并萃取液，減壓干燥；取經(jīng)過上述溶劑萃取后的水溶液，減壓濃縮至干。將5份提取物稱重后粉碎，分別用糊精配制質(zhì)量濃度為藥材－糊精（10∶1）的1號(hào)提取物（水提物）、2號(hào)提取物（石油醚提取物）、3號(hào)提取物（乙酸乙酯提取物）、4號(hào)提取物（正丁醇提取物）和5號(hào)提取物（剩余提取物）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物指紋圖譜分析

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相A：0.2%磷酸水溶液，B：乙腈；梯度洗脫。流速：1 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm；柱溫：25℃；記錄60 min譜圖。

2.1.2 供試品溶液制備 分別準(zhǔn)確稱取1～5號(hào)提取物各2 g，加蒸餾水50mL，稱重?；亓魈崛? h，靜置冷卻至室溫，稱重，用蒸餾水補(bǔ)足失重，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜濾過，分別取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3 HPLC指紋圖譜分析 取各供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，5個(gè)提取物以提取物1為準(zhǔn)共得到36個(gè)色譜峰，見圖1～5，用X1～X36分別代表各色譜峰校正后的峰面積。

圖1 1號(hào)提取物的HPLC指紋圖譜

圖2 2號(hào)提取物的HPLC指紋圖譜

圖3 3號(hào)提取物的HPLC指紋圖譜

圖4 4號(hào)提取物的HPLC指紋圖譜

圖5 5號(hào)提取物的HPLC指紋圖譜

將原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸和咖啡酸混合對(duì)照溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖，并將保留時(shí)間與樣品各指紋峰比較，確認(rèn)10、13、14、16號(hào)峰分別為原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、咖啡酸，見圖6。

2.2 抑菌試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)方法 提取物分別用無菌蒸餾水配制成0.4 g·mL－1。將供試細(xì)菌的新鮮菌苔用白金耳接種至瓊脂培養(yǎng)基，36.5℃恒溫培養(yǎng)18 h后，將細(xì)菌溶于2 mL 0.9%氯化鈉溶液中，配制成濁度為0.5的菌懸液。用無菌棉簽蘸取0.1 mL菌懸液，均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基及血瓊脂培養(yǎng)基表面，用直徑為8 mm的無菌打孔器在培養(yǎng)基上垂直方向打4個(gè)孔，相鄰兩孔的距離大于3 cm。每個(gè)平皿內(nèi)分別加提取物藥液、蒸餾水作為陰性對(duì)照，加兩孔作為平行樣，各做2個(gè)平皿，每孔加0.2mL藥液，36.5℃恒溫培養(yǎng)18 h。采用 “十字交叉”法測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算抑菌圈直徑的平均值［2-3］。

2.2.2 提取物對(duì)供試菌株的抑菌作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肺炎鏈球菌、白色念珠菌對(duì)上述提取物均不敏感；金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、痢疾志賀菌對(duì)1、3、4、5號(hào)提取物表現(xiàn)為高度敏感（抑菌圈直徑＞19 mm）或中度敏感（抑菌圈直徑介于13～19 mm）［3］。結(jié)果見表1。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，火絨草藥材具有較強(qiáng)的抑菌作用，對(duì)許多致病菌，如金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、痢疾志賀菌等具有明顯的抑制作用，這一結(jié)果也與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

2.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 將指紋圖譜化學(xué)數(shù)據(jù)和抑菌試驗(yàn)數(shù)據(jù)組成原始數(shù)據(jù)矩陣，自變量X1～X36代表各色譜峰校正后的峰面積，因變量Y1～Y6分別代表金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、痢疾志賀菌的抑菌圈直徑，組成矩陣，采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用相關(guān)分析的方法探討火絨草藥材中抑菌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)［4］。

2.2.4 相關(guān)分析 相關(guān)分析Correlate是研究變量之間密切程度的一種統(tǒng)計(jì)方法，當(dāng)分析多個(gè)變量之間的關(guān)系，而這種關(guān)系又往往是變量之間的數(shù)量關(guān)系時(shí)，通常采用雙變量Bivariate相關(guān)分析方法。使用SPSS軟件（13.0版）中的雙變量相關(guān)分析可以得到變量?jī)蓛芍g的皮爾遜系數(shù)（Pearson Correlation Coefficients）及其統(tǒng)計(jì)量。

表1 提取物對(duì)供試菌株的抑菌作用（n＝6）／mm

與Y1密切正相關(guān)的變量有：X11、X14、X16、X24、X25、X28、X30、X34；與 Y2密切正相關(guān)的變量有：X7、X11、X13、X14、X16、X24、X25、X28、X30、X31、X34、X35、X36；與 Y3密切正相關(guān)的變量有：X14、X16、X25、X35、X36；與 Y4密切正相關(guān)的變量有：X7、X14、X16、X28、X31、X36；與 Y5密切正相關(guān)的變量有：X13、X14、X24、X28、X34、X35；與 Y6密切正相關(guān)的變量有：X14、X16、X25、X35、X36。與這些色譜峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分可能是有效抑菌成分。

2.2.5 回歸分析 采用 “有進(jìn)有出”的回歸分析方法，從一個(gè)自變量開始，視各自變量X對(duì)因變量Y作用程度的顯著，將顯著變量逐個(gè)引入回歸方程，而原引入的變量因后引入的新變量而變得不顯著時(shí)，則將其剔除，每一步都進(jìn)行F檢驗(yàn)，以保證方程中只包含顯著變量。這個(gè)過程反復(fù)進(jìn)行直到再無新變量引入，也無變量被剔除，逐步回歸完成，建立回歸方程。共有 X5、X14、X16、X17、X24、X28、X31、X36等20個(gè)變量被引入回歸方程，其中X5、X17與提取物的抑菌作用呈負(fù)相關(guān)，與藥效預(yù)期的結(jié)果相反，因此被剔除。在分析過程中同時(shí)發(fā)現(xiàn)有多重共線性情 況， 變 量 X7、X10、X11、X13、X18、X21、X25、X30、X34、X35與被引入的變量的相關(guān)系數(shù)接近1，且這些組分與Y值呈正相關(guān)，因此這10個(gè)化學(xué)組分可能是火絨草抑菌的藥效物質(zhì)。

經(jīng)過相關(guān)和回歸分析，可初步確定 X7、X10、X11、X13、X14、X16、X18、X21、X24、X25、X28、X30、X31、X34、X35、X36為火絨草抑菌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 討論

中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是中藥現(xiàn)代化的研究核心，以中藥的主要功效和配伍理論為指導(dǎo)，采用恰當(dāng)?shù)乃幚砟Ｐ驮u(píng)價(jià)藥效，利用現(xiàn)代分離、分析技術(shù)篩選、提取、分離與藥效密切相關(guān)的化學(xué)成分群，進(jìn)而闡明化學(xué)成分與藥理活性的關(guān)系，確定中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，是中藥現(xiàn)代化基礎(chǔ)研究的主要內(nèi)容。

本研究將指紋圖譜技術(shù)運(yùn)用于復(fù)雜成分的化學(xué)信息采集，將化學(xué)信息與藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果相關(guān)聯(lián)，對(duì)關(guān)聯(lián)結(jié)果進(jìn)行降維處理，得出與藥效相關(guān)性比較大的少數(shù)組分作為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，探索了中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的思路。綜上所述，研究了中藥火絨草的色譜指紋圖譜和抑菌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，初步將36個(gè)色譜峰中的16個(gè)確定為火絨草抑菌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究對(duì)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究進(jìn)行了有意義的探索，對(duì)中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究也有一定的借鑒意義。

中藥材及中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的難點(diǎn)，主要體現(xiàn)在其化學(xué)成分的復(fù)雜性上，中藥及其復(fù)方的化學(xué)成分通常有數(shù)十甚至上百種，而且藥材來源、加工工藝、藥味加減、劑量和配比等因素也會(huì)直接影響中藥復(fù)方化學(xué)組成以及中藥及其復(fù)方的療效。目前，中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究思路和研究方法尚不成熟，現(xiàn)有的研究方法主要有：傳統(tǒng)的化學(xué)研究方法、拆方研究、中藥有效部位研究、中藥指紋圖譜的研究、中藥血清藥物化學(xué)研究、代謝物組學(xué)、細(xì)胞膜生物色譜法等。我們采用中藥指紋圖譜化學(xué)信息與藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果相關(guān)聯(lián)的方法，確定了中藥材具有藥效作用的化學(xué)成分，為有效成分分離、鑒定及其藥效作用的確定提供理論指導(dǎo)，是中藥材及中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的有效手段。

［1］黃利權(quán)，伍義行.火絨草的抗菌活性研究［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2006，（1）：5-7.

［2］伍義行，王建國.火絨草抑菌作用試驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2000，11（4）：289-290.

［3］陳林娜，周立勤，王漢敏，等.中藥對(duì)臨床耐藥菌株的體外抑菌試驗(yàn)觀察［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2005，15（1）：118-120.

［4］沈嵐，張梁，馮怡，等.芍藥甘草復(fù)方效應(yīng)組分譜效關(guān)系研究［J］.中國中藥雜志，2009，33（22）：2658-2662.

Study on Antibacterial Substances in Leontopodium leontopodioides（W illd.）Beauv.

JIANG Hong，SHAN Guo-shun，QIYue，ZHAO Yue，YOU Xian-min（Medical Research Institute of Liaoning Province，Shenyang110034，China）

Objective：Study on the antibacterial pharmacodynaic material inLeontopodium leontopodioides（Willd.）Beauv..M ethods：SPSS statistical analysismethod was used for correlation and regression analysis by the relative area of 36 chromatographic peaks as independent variables，and bacteriostatic ring diameter of extracts as dependent variables.Results：Correlation coefficients of 36 chromatographic peaks were got.Conclusion：Chemical constituents inLeontopodium leontopodioides（Willd.）Beauv.corresponding with 16 chromatographic peaks were preliminary determined having antibacterial activity，in which，chromatographic peak X10is protocatechuic acid，X13is protocatechuic aldehhye，X14is chlorogenic acid，and X16is caffeic acid.

Leontopodium leontopodioides（Willd.） Beauv.；Material basis；Correlation analysis；Regression analysis；Antibacterial action

△［基金項(xiàng)目］遼寧省科技廳項(xiàng)目（2007403019）

*［通訊作者］姜鴻，Tel：（024）86803184，E-mail：jh0723＠126.com

2012-03-22）