索拉菲尼對(duì)肝硬化大鼠部分肝切除術(shù)后肝臟再生的影響*

周小虎， 張紅衛(wèi)， 萬(wàn)云樂(lè)

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院肝膽外科， 廣東 廣州 510120)

1000-4718(2012)03-0528-06

2011-10-24

2011-12-07

北京市希思科臨床腫瘤學(xué)研究基金會(huì)基金資助項(xiàng)目 (No.Y-2009-017).

△通訊作者 Tel：020-34071170；E-mail：hongweizhang88@126.com

·短篇論著·

索拉菲尼對(duì)肝硬化大鼠部分肝切除術(shù)后肝臟再生的影響*

周小虎， 張紅衛(wèi)△， 萬(wàn)云樂(lè)

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院肝膽外科， 廣東 廣州 510120)

目的在大鼠肝硬化模型的基礎(chǔ)上行肝臟部分切除(PH)，研究索拉菲尼(sorafenib)對(duì)大鼠肝臟再生的影響。方法使用二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)Wistar大鼠肝硬化，成功建立30只肝硬化大鼠PH模型后，隨機(jī)分2組，每組15只。術(shù)后第1 d開(kāi)始，分別給予實(shí)驗(yàn)組索拉菲尼(30 mg·kg-1·d-1)、對(duì)照組生理鹽水灌胃10 d后處死。留取PH后及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的血液及肝臟標(biāo)本，檢測(cè)2組肝臟再生率(LRR)，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，生化指標(biāo)： 丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)和血清白蛋白(ALB)、血清總膽紅素(TBIL)和血清直接膽紅素(DBIL)的變化，血管生成相關(guān)因子：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR-2)、血小板源性生長(zhǎng)因子受體β(PDGFR-β)，以及肝臟微血管密度(MVD)的變化。結(jié)果(1)LRR在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組分別為45.43%±3.36%和44.21%±2.77%，無(wú)顯著差異(P>0.05)；(2)免疫組織化學(xué)(IHC)沒(méi)有檢測(cè)到PCNA；(3)2組的生化指標(biāo)無(wú)顯著差異(P>0.05)；(4)實(shí)驗(yàn)組VEGFR-2和PDGFR-β的表達(dá)受到抑制，MVD降低，并且實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。結(jié)論索拉菲尼雖然對(duì)肝硬化血管再生相關(guān)因子有抑制作用，但是對(duì)肝細(xì)胞再生和肝功能沒(méi)有明顯影響。

索拉菲尼； 肝硬化； 肝再生； 肝切除術(shù)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤中排第6位，在全球癌癥相關(guān)致死亡原因中排第3位[1]。肝細(xì)胞癌是少有的幾個(gè)有明確危險(xiǎn)因素的癌癥之一，大約80%的HCC病例發(fā)生在肝硬化基礎(chǔ)上，因此肝硬化這一癌前病變是發(fā)生肝細(xì)胞癌的最強(qiáng)誘因[2]。手術(shù)是HCC的主要治療手段，早期HCC患者手術(shù)切除后5年生存率可達(dá)50%, 但是HCC的術(shù)后復(fù)發(fā)率很高，術(shù)后3年復(fù)發(fā)率為50%，5年復(fù)發(fā)率則高達(dá)70%[3]。

索拉非尼(sorafenib)是一種多激酶抑制劑，它對(duì)多種受體酪氨酸激酶[如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體 2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2)、血小板源性生長(zhǎng)因子受體(platelet derived growth factor receptor，PDGFR)、Fms樣酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3)、Ret、c-Kit和絲氨酸/蘇氨酸激酶(b-Raf, p38)]發(fā)揮抑制活性，通過(guò)抑制VEGFR-2和PDGFR的活性抑制新生血管的形成進(jìn)而影響腫瘤血供，以及通過(guò)Raf激酶通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡[4]。Ⅲ期隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)證實(shí)，索拉非尼用于治療晚期HCC可使患者的生存時(shí)間延長(zhǎng)3個(gè)月[5-7]。由于臨床上大部分肝癌病人合并肝硬化，其中部分肝癌病人的切除手術(shù)難以達(dá)到根治性切除，而目前已知索拉菲尼是唯一被證明有效的治療肝癌的系統(tǒng)性治療藥物。 所以，在非根治性肝癌切除術(shù)后早期應(yīng)用索拉菲尼能否抑制殘留癌細(xì)胞的生長(zhǎng)從而提高生存率已成為臨床關(guān)注的熱點(diǎn)。然而，在肝硬化病人肝部分切除術(shù)后的早期，索拉菲尼是否會(huì)抑制肝硬化的肝細(xì)胞增殖，并導(dǎo)致肝功能不全，目前仍不清楚。因此，本研究通過(guò)建立肝硬化大鼠部分肝臟切除模型，研究索拉菲尼對(duì)肝硬化肝臟再生及肝功能的影響。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物及分組

雄性Wistar大鼠，體重170～200 g，喂養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境。索拉菲尼溶解于聚氧乙烯蓖麻油/95% 乙醇 (50∶50，Sigma)，室溫避光保存。在大鼠形成明顯肝硬化后行30%肝部分切除術(shù)(partial hepatectomy , PH)后隨機(jī)分2組，每組15只。術(shù)后第1 d開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組給予索拉菲尼(30 mg·kg-1·d-1)，對(duì)照組給予生理鹽水，喂養(yǎng)10 d后處死。收集PH后以及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的大鼠血液及肝臟標(biāo)本。血液用于肝臟生化檢測(cè)，每份肝組織一部分置于多聚甲醛固定24 h后石蠟包埋用于免疫組化檢測(cè)，一部分置于液氮速凍后凍存用于Western blotting 分析。

2大鼠肝硬化肝臟部分切除模型的建立

參照華赟鵬等[8]誘導(dǎo)大鼠肝硬化方法，Wistar大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，每天自由飲用含0.095 g/L 二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)(Sigma)的純水60 d后形成明顯的肝硬化，蘇木素-伊紅(HE)染色: 肝內(nèi)假小葉明顯形成。2 d后按照Higgins等[9]方法進(jìn)行30%部分肝(肝左葉)切除：所有大鼠術(shù)前均禁食24 h，不禁水。戊巴比妥鈉(3O mg/kg)腹腔注射全麻。取腹部正中切口進(jìn)腹，暴露肝臟左葉，游離肝左葉并結(jié)扎其血管，進(jìn)而切除肝左葉。模型大鼠術(shù)后分組如上述介紹。

3指標(biāo)測(cè)定

3.1肝臟再生率(liver regeneration rate，LRR)的測(cè)定 參照Fan等[10]的實(shí)驗(yàn)方法，預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們得到了切除肝重(resected liver weight，RLW)與總肝重(total liver weight)的比值，由此根據(jù)切除的肝重和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后殘余肝重(remnant liver weight)，我們得出肝臟再生比率LRR=(Mb-Ma)/Ma×100%。其中Ma為肝部分切除術(shù)后大鼠理論殘肝質(zhì)量，Mb為處死大鼠取標(biāo)本時(shí)的殘余肝質(zhì)量。

3.2肝臟生化指標(biāo)的測(cè)定 處死大鼠時(shí)，從下腔靜脈采集血液進(jìn)行生化檢測(cè)：血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT),血清白蛋白(albumin，ALB),總膽紅素(total bilirubin，TBIL),直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)。用于評(píng)估肝臟功能。

3.3增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)及肝臟血管再生相關(guān)因子VEGFR-2、PDGFR-β、CD31的免疫組化檢測(cè) 留取的肝臟組織經(jīng)多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋。連續(xù)切片，厚4 μm。切片常規(guī)脫蠟后蒸餾水沖洗5 min；用30 mL/L H2O2孵育30 min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)抗原修復(fù)10 min，用10 mL/L正常小牛血清孵育20 min封閉；分別滴加Ⅰ抗[PCNA(Dako),PCI0 MAb 1∶50;VEGFR-2(ab39638 goat polyclonal,Abcam,1∶50);PDGFR-β(SC-339 goat polyclonal);CD-31(SC-1506 goat polyclonal；Santa Cruz Biotechnology,diluted 1∶100)]，4 ℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次×5 min；加多聚體的Ⅱ抗(中杉金橋，PV-6001 PowerVisionTMTwo-Step Histostaining Reagent 二步法免疫組化檢測(cè)試劑)，室溫孵育30 min；PBS徹底沖洗；DAB顯色液(中杉金橋，ZLI-9017 DAB Kit) 染色2～5 min。蘇木素復(fù)染；系列乙醇脫水,二甲苯透明；樹(shù)膠封片觀察。 組織片置于顯微鏡下×400觀察，每張片隨機(jī)選取4個(gè)視野，并用數(shù)碼相機(jī)(Nikon ECLIPSE, Nis-elment)拍照獲取圖片數(shù)據(jù)。

3.4Western blotting 檢測(cè)VEGF、VEGFR-2和PDGFR-β的表達(dá) 肝臟組織液氮速凍后-80 ℃冰箱凍存。肝臟組織蛋白提取按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作: 稱取100 mg肝組織液氮下研磨成粉狀加入細(xì)胞裂解液RAPA及蛋白酶抑制劑PUSF，冰上靜止30 min然后4°離心30 min提取總蛋白。蛋白樣品用樣品緩沖液進(jìn)行稀釋并煮沸。30 μg蛋白樣品通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分離，然后點(diǎn)轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%(W/V)脫脂奶粉封閉，孵育Ⅰ抗[(兔抗大鼠 VEGF(1∶2 000)，VEGFR-2(1∶2 000)，PDGFR-β(1∶2 000)]4 ℃過(guò)夜，洗膜, 孵育羊抗兔結(jié)合的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶3 000)常溫1 h，洗膜30 min,然后蛋白條帶使用ECL發(fā)光及Western blotting(Amersham Life Science)檢測(cè)。Quantity One 軟件用于分析蛋白條帶。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1LRR的比較

結(jié)果顯示,術(shù)后大鼠殘余肝細(xì)胞迅速增殖，肝臟體積增大，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組10 d的LRR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(45.43% ± 3.36%vs44.22% ± 2.77%，P>0.05))。

2肝細(xì)胞PCNA的比較

大鼠肝部分切除術(shù)后10 d，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)2組肝臟細(xì)胞核中陽(yáng)性染色，2組PCNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3肝臟生化指標(biāo)

結(jié)果顯示,肝部分切除術(shù)后10 d，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝功能指標(biāo)在服用索拉菲尼前后沒(méi)有顯著變化，并且實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組肝功指標(biāo)亦無(wú)顯著區(qū)別(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1Sorafenib組、對(duì)照組及肝部分切除術(shù)前肝硬化大鼠的肝功能指標(biāo)

4肝臟血管再生相關(guān)因子及微血管的變化

4.1索拉菲尼對(duì)VEGFR-2表達(dá)的抑制作用 圖2顯示，大鼠肝臟部分切除術(shù)后10 d后， 對(duì)照組VEGFR-2較處理前增加了36.5%(P<0.01)。用索拉菲尼(30 mg·kg-1·d-1)10 d后，實(shí)驗(yàn)組VEGFR-2的表達(dá)較對(duì)照組減少了36.7% (P<0.01)。圖3顯示，與處理前相比，對(duì)照組VEGFR-2表達(dá)增加，用索拉菲尼 10 d后顯著抑制VEGFR-2的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比有顯著差異(P<0.01)。

4.2索拉菲尼對(duì)PDGFR-β表達(dá)的抑制作用 結(jié)果顯示,與處理前相比，對(duì)照組PDGFR-β增加了24.2%，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比減少49.8%(P<0.01)，見(jiàn)圖2、3。

4.3索拉菲尼對(duì)VEGF的影響 VEGF在對(duì)照組中并沒(méi)有伴隨VEFGR-2以及PDGFR-β的表達(dá)升高而升高，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

4.4索拉菲尼對(duì)肝內(nèi)新生血管的影響 免疫組化結(jié)果顯示，與處理前相比，對(duì)照組的殘肝中CD31陽(yáng)性血管增加了76.3%；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組CD31陽(yáng)性血管減少了73.2%。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖2免疫印跡分析Sorafenib組、對(duì)照組及肝部分切除的肝組織中VEGFR-2、PDGFR-β及VEGF的表達(dá)

圖3免疫組化分析Sorafenib組、對(duì)照組及肝部分切除的肝組織中VEGFR-2、PDGFR-β及CD31的表達(dá)

討 論

肝臟部分切除術(shù)后其再生的研究已在多個(gè)動(dòng)物模型中開(kāi)展[11,14-19]。我們?cè)诟斡不Ｐ偷幕A(chǔ)上，研究多激酶抑制劑索拉菲尼對(duì)肝臟再生、肝臟功能及肝內(nèi)血管生成是否具有抑制作用。這種關(guān)注于肝硬化基礎(chǔ)上肝臟再生的研究，對(duì)于任何新藥的療效和潛在的臨床應(yīng)用性的轉(zhuǎn)化型研究來(lái)說(shuō)都是必要的。

我們的研究表明，索拉菲尼對(duì)肝硬化大鼠部分肝臟切除后肝臟再生、肝臟生化、肝細(xì)胞增殖沒(méi)有顯著影響，而對(duì)肝內(nèi)血管再生等因子有明顯的抑制作用。我們的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠肝臟切除后觀察10 d，發(fā)現(xiàn)2組肝臟都迅速再生且很快恢復(fù)到正常肝臟功能，2組殘肝再生比率沒(méi)有顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后殘肝標(biāo)本中沒(méi)能檢測(cè)到PCNA，其可能原因是：肝臟再生后達(dá)到穩(wěn)定期，肝細(xì)胞分裂增殖停止，不再產(chǎn)生PCNA。肝臟能夠精確的調(diào)節(jié)肝的生長(zhǎng)及體積，肝細(xì)胞減少能觸發(fā)肝細(xì)胞復(fù)制,增大的肝臟則誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡以恢復(fù)到最佳肝體重比率、恢復(fù)肝臟正常功能及體積[20]。 并且有研究證明肝細(xì)胞在正常情況下很少分裂增殖，但在肝臟部分切除后24 h就有PCNA表達(dá)陽(yáng)性，48 h達(dá)到最高點(diǎn)，隨后減少，術(shù)后10 d就可恢復(fù)到正常水平[11]。

VEGFR-2及PDGFR-β對(duì)多階段血管生成過(guò)程的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[21-22]。然而索拉菲尼對(duì)肝內(nèi)血管再生等因子的抑制作用比較明顯，觀察10 d證實(shí)索拉菲尼在實(shí)驗(yàn)組中明顯抑制了VEGFR-2及PDGFR-β，這在索拉菲尼治療惡性腫瘤多項(xiàng)研究中得到體現(xiàn)[4, 23-24]。腫瘤與VEGFR-2和PDGFR-β密切相關(guān)，并且多項(xiàng)研究證明VEGFR-2和PDGFR-β可以促進(jìn)血管再生促進(jìn)腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)VEGFR-2和PDGFR-β在肝臟部分切除術(shù)后明顯升高，這可能是肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵因素。闞和平等[25]研究表明索拉菲尼對(duì)于富含微血管的肝細(xì)胞癌肝移植后腫瘤復(fù)發(fā)有良好的抑制作用。我們的結(jié)果證實(shí)實(shí)驗(yàn)組的血管生成較對(duì)照組減少約73.2%。對(duì)照組血管生成的增加并沒(méi)有伴隨VEGF的的高表達(dá)，并且其在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的表達(dá)并沒(méi)有明顯變化，這可能是因?yàn)樗骼颇岵挥绊慥EGF的表達(dá)。另有觀點(diǎn)認(rèn)為：肝硬化早期增加的VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管的形成，而晚期階段，新生血管的穩(wěn)定與成熟主要通過(guò)其它生長(zhǎng)因子來(lái)調(diào)節(jié)[26-27]。無(wú)論如何，血管生成是一個(gè)多因素的極其復(fù)雜的過(guò)程，由多種因子在不同水平進(jìn)行調(diào)節(jié)[22]。

總之，我們的研究為證明索拉菲尼對(duì)肝硬化部分肝臟切除術(shù)后肝臟再生及血管生成的影響提供了有力的體內(nèi)證據(jù)。索拉菲尼雖然可以抑制肝內(nèi)血管再生相關(guān)因子的表達(dá)，但是不影響肝細(xì)胞的增殖，不影響肝臟的再生及肝功能。

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Effectofsorafenibonliverregenerationafterpartialhepatoectomyinlivercirrhoticrats

ZHOU Xiao-hu, ZHANG Hong-wei, WANG Yun-le

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:hongweizhang88@126.com)

AIM: To study the effect of sorafenib on the liver regeneration after partial hepatectomy (PH) in cirrhotic rats.METHODSThirty Wistar rats with liver cirrhosis induced successfully with diethylnitrosamine (DEN) underwent 30% PH and then were randomly divided into 2 groups (n=15). The rats in experimental group were fed with sorafenib at dose of 30 mg·kg-1·d-1from the 1st day to the 10th day after PH, while those in control group were fed with vehicle by gavage. The blood and liver tissues of the rats were collected after PH and at the end of the experiment. Liver regeneration rate (LRR) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression were assessed for determining the hepatocyte proliferation. The content of alanine transaminase (ALT), albumin (ALB), total bilirubin (TBIL), direct bilirubin (DBIL), angiogenesis related factors including vascular endothelial growth factor (VEGF), vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2), platelet-derived growth factor receptor β (PDGFR-β) and micro-vessel density (MVD) were measured in both groups.RESULTSLRRs on day 10 after PH were 45.43%±3.36% and 44.21%±2.77% in experimental group and control group, respectively (P>0.05), and the expression of PCNA in hepatic tissues of the rats was not found by the method of immunohistochemistry in both groups. Liver function index had no significant difference between the 2 groups (P>0.05). However, other than VEGF, sorafenib resulted in inhibition of VEGFR-2 and PDGFR-β expression and reduction of MVD in experiment group, and significant difference between the 2 groups was observed (P<0.01).CONCLUSIONSorafenib does not influence live regeneration after PH in liver cirrhotic rats.

Sorafenib; Liver cirrhosis; Liver regeneration; Hepatectomy

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.025