脂氧素A4抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞環(huán)氧合酶2及前列腺素E2的表達(dá)*

朱天琦, 鄭聲星, 金勝威

(溫州醫(yī)學(xué)院1附屬第一醫(yī)院麻醉科，2附屬第二醫(yī)院麻醉科，3附屬第二醫(yī)院ICU，浙江 溫州 325000)

1000-4718(2012)03-0478-05

2011-07-09

2011-12-09

國家自然科學(xué)基金資助資助項(xiàng)目(No.81070061);浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.Y2100885)；浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)項(xiàng)目

△通訊作者 Tel: 0577-88879006; E-mail: jinshengwei69@yahoo.com.cn

脂氧素A4抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞環(huán)氧合酶2及前列腺素E2的表達(dá)*

朱天琦1, 鄭聲星2, 金勝威3△

(溫州醫(yī)學(xué)院1附屬第一醫(yī)院麻醉科，2附屬第二醫(yī)院麻醉科，3附屬第二醫(yī)院ICU，浙江 溫州 325000)

目的探討脂氧素A4對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞(HBECs)環(huán)氧合酶2(COX-2)表達(dá)的影響。方法應(yīng)用不同濃度(0.1、1、10 mg/L)的內(nèi)毒素(LPS)刺激HBECs 9 h，或者用1 mg/L LPS分別刺激HBECs不同時(shí)點(diǎn)(3 h、6 h、9 h)后，測定HBECs的COX-2 mRNA表達(dá)和細(xì)胞上清液前列腺素E2(PGE2)水平。應(yīng)用不同濃度 (0、100、400 μmol/L) 的脂氧素A4作用于經(jīng)過LPS(1 mg/L)刺激培養(yǎng)9 h的HBECs，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細(xì)胞上清液PGE2的水平, 同時(shí)分別應(yīng)用RT-PCR和Western blotting分別檢測HBECs COX-2 mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果LPS刺激培養(yǎng)條件下HBECs的COX-2 mRNA表達(dá)及其上清液PGE2水平增加，并呈時(shí)間、劑量依賴性。脂氧素A4能抑制LPS刺激培養(yǎng)HBECs COX-2蛋白和mRNA的表達(dá)及上清液PGE2的水平，并呈劑量依賴性。結(jié)論脂氧素A4能抑制LPS誘導(dǎo)的HBECs COX-2表達(dá)及上清液PGE2的水平。

脂氧素A4; 人支氣管上皮細(xì)胞; 環(huán)氧合酶2; 脂多糖類

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是臨床常見危重病，其病死率達(dá)35%～58%[1]，內(nèi)毒素血癥引起的ARDS極為常見。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為急性炎癥效應(yīng)細(xì)胞主要有白細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等，目前越來越多證據(jù)表明人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells, HBECs)不僅作為構(gòu)成外部環(huán)境與機(jī)體內(nèi)環(huán)境相互作用的一道屏障，也可以作為急性炎癥效應(yīng)細(xì)胞[2]。在呼吸道炎癥疾病中人支氣管上皮細(xì)胞能分泌炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子如前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)等，同時(shí)能表達(dá)環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)[3]。COX-2 是合成前列腺素的關(guān)鍵限速酶, 在急性炎癥時(shí)受多種炎癥介質(zhì)(如細(xì)胞因子)刺激而大量表達(dá)[3-4]。脂氧素(lipoxins, LXs)是一類重要的內(nèi)源性脂質(zhì)抗炎介質(zhì)，是花生四烯酸(arachidonic acid, AA)的脂加氧酶(lipoxygenase)代謝產(chǎn)物, 由5-脂加氧酶(5-lipoxygenase)與15-脂加氧酶(15-lipoxygenase)或者由5-脂加氧酶(5-lipoxygenase)與12-脂加氧酶(12-lipoxygenase)作用而形成[5]，主要通過跨細(xì)胞途徑來合成 ,在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮廣泛的抗炎促炎癥消退作用[6]。本文通過對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞在內(nèi)毒素直接刺激下其環(huán)氧合酶-2及PGE2表達(dá)和脂氧素A4(LXA4)對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞COX-2及PGE2表達(dá)的影響進(jìn)行研究，闡明脂氧素A4在抑制支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的機(jī)制和作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細(xì)胞株 人支氣管上皮細(xì)胞(武漢大學(xué)保藏中心)。

1.2主要試劑 新生牛血清、DMEM培養(yǎng)基均購自Gibco，脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,E.coliserotype O55∶B5)及瓊脂糖(Sigma), Trizol( Invitrogen),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas),TAG酶及dNTP (Tiangen),二乙基焦碳酸酯 (DEPC,武漢博士德生物工程有限公司), COX-2引物及陽性對(duì)照GAPDH引物(上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成),兔抗人COX-2抗體(Abcam),辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉公司),PGE2ELISA試劑盒(R&D), BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 人支氣管上皮細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于10%新生牛血清、青霉素1×105IU/L、鏈霉素1×105IU/L的 DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞呈融合狀態(tài)時(shí)，無血清 DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分4組: (1)正常對(duì)照組：不給予任何處理；(2)9 h LPS處理組：同一時(shí)點(diǎn)(9 h)給予不同濃度 LPS(0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L)；(3)1 mg/L LPS處理組：不同時(shí)點(diǎn)(3 h、6 h、9 h)給予同一濃度LPS(1 mg/L)刺激(3 h、6 h、9 h)；(4)脂氧素A4及LPS處理組：給予不同濃度(0 μmol/L、100 μmol/L、400 μmol/L)脂氧素A4加上LPS(1 mg/L)刺激9 h。

2.2ELISA法檢測細(xì)胞上清液中PGE2的含量 LPS及脂氧素A4作用結(jié)束后收集細(xì)胞上清液，2 000 r/min離心 5 min后待測。按照R&D公司ELISA試劑盒說明書操作，檢測細(xì)胞上清液中PGE2的含量。

2.3半定量 RT- PCR檢測 COX-2 mRNA的表達(dá) 取不同實(shí)驗(yàn)組的人支氣管上皮細(xì)胞，采用Trizol試劑，參照說明書對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的總 RNA進(jìn)行提取。取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，其中1 μL cDNA為模板，擴(kuò)增 COX-2。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min， 94 ℃ 45 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 3 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 7 min。取 5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙啶 (EB) 顯色，目的條帶用圖像分析系統(tǒng)做灰度值測定，以GAPDH為內(nèi)參照，COX-2與GAPDH灰度值比值作為COX-2 mRNA的相對(duì)含量進(jìn)行半定量分析。COX-2的引物序列：上游引物5’-AAGCTGGGAAGCCTTCTCTA-3’,下游引物5’-TTTCCATCCTTGAAAAGGCGC-3’ ,擴(kuò)增片段長度為342 bp。GAPDH的引物序列：上游引物 5’-ACCAGCCCCAGCAAGAGCACAAG-3’，下游引物5’- TTCAAGGGGTCTACATGGCAACTG -3’，擴(kuò)增片段長度為123 bp，反應(yīng)條件： 94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 3 min。

2.4Western blotting檢測COX-2蛋白的表達(dá) 取1 mg/L LPS合并不同濃度LXA4誘導(dǎo)培養(yǎng)9 h后的支氣管上皮細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液，冰上孵育 40 min，12 000 r/min離心20 min，上清液即為總蛋白，參照BCA蛋白定量試劑盒說明書測蛋白濃度。將總蛋白進(jìn)行SDS PAGE凝膠電泳,然后電轉(zhuǎn)移至NC膜上。用5%脫脂牛奶對(duì)膜室溫封閉1 h，加入兔抗人COX-2和小鼠抗人β-actin多克隆抗體(COX-2以 1∶500稀釋，β-actin以 1∶2 000稀釋 ) 4 ℃搖動(dòng)過夜。第2 d用 TBST于室溫下洗膜3次，每次15 min，接著加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(1∶2 000稀釋 )及山羊抗小鼠IgG抗體(1∶2 000稀釋 )，在室溫下輕輕搖動(dòng)1 h，然后用TBST室溫下洗膜 3次，每次15 min。最后用化學(xué)發(fā)光法曝光顯跡，按化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒 (ECL)說明要求加入ECL試劑，室溫下溫育 2 min后對(duì) X線片曝光。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1LPS刺激下人支氣管上皮細(xì)胞COX-2mRNA的表達(dá)及其上清液PGE2含量呈劑量、時(shí)間依賴關(guān)系

通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，正常人支氣管上皮細(xì)胞中COX-2 mRNA有微量表達(dá)，LPS誘導(dǎo)后支氣管上皮細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)增加，與對(duì)照組相比有差異顯著(P< 0.01)；用不同濃度 LPS(0.1、1和10 mg/L) 刺激細(xì)胞9 h后, COX-2 mRNA表達(dá)亦隨之增多，1 mg/L、10 mg/L組 LPS刺激COX-2 mRNA表達(dá)達(dá)到高峰，兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與0.1 mg/L組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1A，1B。用1 mg/L LPS刺激培養(yǎng)HBECs后，在不同時(shí)點(diǎn)(3 h、6 h、9 h)COX-2 mRNA表達(dá)亦增多, 并呈時(shí)間依賴關(guān)系，9 h組與3 h、6 h組相比顯著差異(P< 0.01)，結(jié)果見圖1A、C。mRNA 表達(dá)的半定量結(jié)果以COX-2/β- actin吸光度的相對(duì)值計(jì)算。而且用LPS刺激HBECs能增加上清液PGE2(PGE2是COX-2主要產(chǎn)物之一)的含量，呈劑量、時(shí)間依賴關(guān)系。LPS誘導(dǎo)后，各組與對(duì)照組相比差異顯著(P< 0.01)，1 mg/L、10 mg/L 組PGE2含量分別為(92.606±1.977)ng/L和(92.716±2.947)ng/L，與0.1 mg/L組[(46.332 ±1.609)ng/L相比有顯著差異(P<0.01)，3 h和6 h組PGE2含量分別為(47.501±1.527)ng/L和(60.918±1.122)ng/L,與9 h組[(91.966±3.246)ng/L]相比有差異顯著(P<0.01)，見圖2。

2脂氧素A4對(duì)LPS刺激的人支氣管上皮細(xì)胞COX-2mRNA及蛋白表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果表明脂氧素A4能抑制LPS刺激的人支氣管上皮細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)，并呈劑量依賴關(guān)系，無脂氧素A4組與對(duì)照組相比顯著差異(P<0.01)，脂氧素A4組與無脂氧素A4組相比差異顯著(P<0.01)，100 μmol/L與400 μmol/L脂氧素A4組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。 正常人支氣管上皮細(xì)胞中COX-2蛋白有微量表達(dá)，脂氧素A4抑制LPS刺激的人支氣管上皮細(xì)胞的COX-2蛋白表達(dá)，也呈濃度依賴關(guān)系，無脂氧素A4組與對(duì)照組相比差異有顯著(P<0.01)，脂氧素A4組與無脂氧素A4組相比差異有顯著(P<0.01)，100 μmol/L與400 μmol/L脂氧素A4組相比差異顯著(P<0.01)，見圖 4。

圖1HBECs在不同濃度(0.1、1、10mg/L)LPS刺激9h后及在1mg/LLPS刺激不同時(shí)間(3h、6h、9h)后COX-2mRNA的表達(dá)

圖2HBECs在不同濃度(0.1、1、10mg/L)LPS刺激9h和1mg/LLPS刺激不同時(shí)點(diǎn)(3、6、9h)后上清液PGE2的水平

圖3脂氧素A4對(duì)LPS刺激的人支氣管上皮細(xì)胞COX-2mRNA的影響

圖4脂氧素A4對(duì)LPS刺激人支氣管上皮細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)的影響

3脂氧素A4對(duì)于LPS刺激的人支氣管上皮細(xì)胞上清液PGE2含量的影響

脂氧素A4能抑制HBECs COX-2表達(dá)，PG因此我們推測脂氧素A4是否也能抑制其產(chǎn)物前列腺素E2的表達(dá)。HBECs上清 ELISA檢測發(fā)現(xiàn),脂氧素A4能抑制LPS刺激后人支氣管上皮細(xì)胞上清中 PGE2的含量，并呈劑量依賴關(guān)系。無脂氧素A4組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)，人支氣管上皮細(xì)胞上清液PGE2從無脂氧素A4組的(97.019±1.425)ng/L降至100 μmol/L脂氧素A4組的(54.077±3.141)ng/L 以及400 μmol/L脂氧素A4組的(39.187±0.775)ng/L (P<0.01)。100 μmol/L與400 μmol/L脂氧素A4組相比差異顯著(P<0.01)，見圖5。

圖5不同濃度脂氧素A4對(duì)HBECsPGE2表達(dá)影響

4相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明脂氧素A4抑制LPS誘導(dǎo)的COX-2蛋白表達(dá)與前列腺素E2水平呈相關(guān)性(r=0.99,P<0.01)。

討 論

急性肺損傷及ARDS是臨床常見急危重癥，病死率極高[7]。目前從針對(duì)內(nèi)毒素性肺損傷的治療中，我們不難發(fā)現(xiàn)抑制炎癥啟動(dòng)階段的促炎介質(zhì)釋放是主旋律[8]。新近研究發(fā)現(xiàn)炎癥是一個(gè)從啟動(dòng)到消退的程序化過程，機(jī)體還存在一整套的炎癥自限機(jī)制來精密調(diào)控炎癥的發(fā)展和消退[9]。在此基礎(chǔ)上提出的“促炎癥消退”的炎癥治療新策略已成為新的研究熱點(diǎn)。

在呼吸系統(tǒng)炎癥中前列腺素類物質(zhì)如PGE2作為主要的炎癥介質(zhì)，起到關(guān)鍵作用[10]。前列腺素類物質(zhì)屬于類花生酸家族，是花生四烯酸經(jīng)過COX催化而產(chǎn)生[10]。COX是花生四烯酸轉(zhuǎn)化成類花生酸類物質(zhì)途徑中重要的限速酶[4]。機(jī)體中主要有2種COX異構(gòu)體：COX-1及COX-2[11]。COX-1屬于管家酶，在大多數(shù)組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，其表達(dá)相對(duì)恒定[12]。 COX-2 在多數(shù)情況下處于靜息狀態(tài)或低表達(dá)，只有在炎癥反應(yīng)或其它病理?xiàng)l件下才大量表達(dá)[13]。在肺部炎癥中也存在COX-2 以及PGE2的高表達(dá)[4]。

在炎癥刺激下，人肺上皮細(xì)胞COX-2表達(dá)增加[3]。另外，COX-2基因敲除的小鼠炎癥反應(yīng)性增加[14]。由于人支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)Toll樣受體4并能分泌PGE2[15],因此本研究應(yīng)用LPS刺激體外培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞，并且利用MTT法(結(jié)果省略)發(fā)現(xiàn)1 mg/L LPS刺激細(xì)胞可以建立體外炎癥模型。目前的研究中，我們也發(fā)現(xiàn)人支氣管上皮細(xì)胞在LPS直接刺激下COX-2 mRNA及PGE2的表達(dá)增加(與MTT結(jié)果相符)，而且我們更進(jìn)一步的研究結(jié)果表明COX-2表達(dá)呈時(shí)間、劑量依賴關(guān)系。

脂氧素是調(diào)節(jié)炎癥消退的重要抗炎介質(zhì)，在對(duì)肺部疾病(如哮喘)體外及體內(nèi)研究都表明脂氧素具有抗炎作用[16-17]。有研究報(bào)道預(yù)先給予脂氧素類似物能減輕內(nèi)毒素所致的小鼠急性肺損傷程度[18]。Medeiros等[19]報(bào)道脂氧素A4同樣能抑制內(nèi)毒素所致大鼠眼葡萄膜炎的環(huán)氧合酶表達(dá)及其活性。另外據(jù)報(bào)道脂氧素能抑制人肺上皮細(xì)胞損傷后的炎癥反應(yīng)并促進(jìn)其向穩(wěn)態(tài)表型轉(zhuǎn)化[15]。本研究發(fā)現(xiàn)脂氧素能抑制LPS刺激培養(yǎng)下人支氣管上皮細(xì)胞COX-2 mRNA及蛋白的表達(dá)，也同時(shí)能抑制其上清液PGE2水平，且存在劑量依賴關(guān)系。數(shù)據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果表明脂氧素A4抑制LPS誘導(dǎo)的COX-2表達(dá)與PGE2產(chǎn)物具有相關(guān)性。因此脂氧素能抑制LPS PGE2產(chǎn)物可能是由于其抑制LPS誘導(dǎo)COX-2表達(dá)所致。綜上所述我們認(rèn)為脂氧素A4可能部分通過依賴COX-2的方式促進(jìn)肺部炎癥消退，為急性肺損傷的治療提供一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

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LipoxinA4reduceslipopolysaccharide-inducedexpressionofcyclooxygenase2andprostaglandinE2inhumanbronchialepithelialcells

ZHU Tian-qi1, ZHENG Sheng-xing2, JIN Sheng-wei3

(1DepartmentofAnesthesia,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,2DepartmentofAnesthesia,3IntensiveCareUnit,TheSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:jinshengwei69@yahoo.com.cn)

AIM: To explore the effects of lipoxin A4on the expression of cyclooxygenase 2 (COX-2) in human bronchial epithelial cells (HBECs).METHODSHBECs were incubated with various concentrations (0.1, 1 and 10 mg/L) of lipopolysaccharide(LPS) for 9 h, or 1 mg/L LPS for different time (3 h, 6 h and 9 h). The levels of COX-2 mRNA in HBECs and prostaglandin E2(PGE2) in the culture supernatant were measured. In addition, the HBECs were exposed to lipoxin A4at concentration of 0, 100 and 400 μmol/L after stimulated with LPS at concentration of 1 mg/L for 9 h, and the supernatant of the culture cells was collected for determining the content of PGE2by ELISA. The cells were also harvested, and the mRNA and protein levels of COX-2 were analyzed by RT-PCR and Western blotting, respectively.RESULTSLPS increased the mRNA expression of COX-2 and production of PGE2in a dose and time dependent manners in HBECs. Induction of COX-2 mRNA and protein by LPS were inhibited by lipoxin A4in a dose-dependent manner. Lipoxin A4also significantly decreased LPS-induced production of PGE2.CONCLUSIONLipoxin A4down-regulates LPS-induced expression of COX-2 and consequently inhibits the production of PGE2in HBECs.

Lipoxin A4; Human bronchial epithelial cells; Cyclooxygenase 2; Lipopolysaccharides

R332.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.016