細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蘭尼堿受體3與ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的關(guān)系*

馮利霞， 葛長(zhǎng)江△， 呂樹(shù)錚， 孫海梅， 季鳳清， 霍 勇

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心內(nèi)科，北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029；2首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，北京100069；3北京大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科，北京100034)

1000-4718(2012)09-1686-04

2012-03-29

2012-07-11

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃(No.2006BAI01A02)；首都醫(yī)學(xué)科技發(fā)展基金資助項(xiàng)目(No.SF-2009-I-09)；首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)與臨床合作基金課題(No.11JL51)

△通訊作者 Tel:010-64456473;E-mail：cjge1116@163.com

·短篇論著·

細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蘭尼堿受體3與ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的關(guān)系*

馮利霞1， 葛長(zhǎng)江1△， 呂樹(shù)錚1， 孫海梅2， 季鳳清2， 霍 勇3

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心內(nèi)科，北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029；2首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，北京100069；3北京大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科，北京100034)

目的觀察細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蘭尼堿受體3(ryanodine receptor 3, RYR3)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程中的改變，探討兩者的相關(guān)性。方法選取6周齡雄性載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠及野生型C57BL/6J小鼠，高脂飼喂20、27和33周后,在各個(gè)時(shí)點(diǎn)處死動(dòng)物取主動(dòng)脈根部制作連續(xù)切片。(1)HE染色，觀察組織形態(tài)學(xué)的變化，計(jì)算機(jī)圖像分析儀測(cè)量斑塊面積和血管管腔面積，計(jì)算校正斑塊面積(斑塊面積/血管管腔面積)。(2)免疫組織化學(xué)染色，計(jì)算機(jī)圖像分析儀測(cè)定不同周齡小鼠細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)YR3表達(dá)變化。結(jié)果與同周齡對(duì)照組小鼠相比，ApoE-/-小鼠體內(nèi)RYR3表達(dá)顯著減少(P<0.05)，隨著ApoE-/-小鼠周齡的增加，RYR3的表達(dá)明顯減少，且與斑塊面積/血管管腔面積呈負(fù)相關(guān)(r=-0.652，P<0.01)。結(jié)論細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)YR3參與動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程，且與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成密切相關(guān)。

蘭尼堿受體3；載脂蛋白E；動(dòng)脈粥樣硬化

作為冠心病的重要始動(dòng)因素，動(dòng)脈粥樣硬化是以血管內(nèi)皮損傷為基礎(chǔ)的多種危險(xiǎn)因素綜合作用的結(jié)果，主要包括血管重塑和易損斑塊形成。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖與凋亡是決定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。已知Ca2+參與細(xì)胞增殖和凋亡的過(guò)程，而Ca2+穩(wěn)態(tài)的維持則受細(xì)胞離子泵的調(diào)控。細(xì)胞離子通道的開(kāi)通和激活與動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病密切相關(guān)[1-2]。Van Assche等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成之前，ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈VSMCs內(nèi)基礎(chǔ)Ca2+水平增高，1, 4, 5-三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor,IP3R)含量及其介導(dǎo)的Ca2+釋放均明顯增高，而蘭尼堿受體(ryanodine receptor, RYR)含量卻未見(jiàn)明顯改變，然而尚不明確動(dòng)脈粥樣硬化斑塊長(zhǎng)期形成過(guò)程中該蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化規(guī)律及其間的關(guān)系。本研究應(yīng)用載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E gene-deficient,ApoE-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，觀察在動(dòng)脈粥樣硬化病程中，主動(dòng)脈VSMCs內(nèi)RYR3表達(dá)的改變，并明確其與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊之間的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物和試劑

6周齡ApoE-/-(品系C57BL/6J,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)并培育)15只，質(zhì)量合格證號(hào)[SCXK(京)2006-0008],野生型C57BL/6J小鼠由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，質(zhì)量合格證號(hào)[SCXK(京)2007-004]。均為雄性,體重18～20 g,飼養(yǎng)條件為2級(jí),室溫保持在22～24 ℃,相對(duì)濕度50%,光照時(shí)間7:00～19:00。RYR3Ⅰ抗購(gòu)自Chemicon，Ⅱ抗、DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2動(dòng)物分組和模型制備

選取15只6周齡ApoE-/-為模型組，野生型C57BL/6J小鼠為對(duì)照組，分別給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料78.85%，脂肪21%，膽固醇0.15%)，喂養(yǎng)20周、27周和33周(每組5只)。在各個(gè)時(shí)點(diǎn)處死動(dòng)物后取主動(dòng)脈根部用 4%多聚甲醛固定,石蠟包埋制備連續(xù)切片。

3方法

3.1標(biāo)本處理 20周齡、27周齡、33周齡時(shí)隨機(jī)各取5只處死動(dòng)物，處死前1 d晚上禁食不禁水。無(wú)菌條件下取出心臟和主動(dòng)脈,10%甲醛固定,脫水,常規(guī)石蠟包埋,小鼠心底部橫斷面連續(xù)切片。每只小鼠的主動(dòng)脈根部取4個(gè)相同的切面[4-5],分別是：(1)升主動(dòng)脈最近端橫截面,切面形態(tài)呈圓形；(2)主動(dòng)脈瓣附著部位,并有冠狀動(dòng)脈開(kāi)口；(3)主動(dòng)脈瓣起始橫截面；(4)主動(dòng)脈瓣完全出現(xiàn)并匯合在一起。每隔100 μm連續(xù)取6張切片,切片厚5 μm,相鄰的2個(gè)切面分別進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)染色。

3.2斑塊面積的測(cè)定 HE染色，形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)定斑塊面積、血管管腔面積(取4個(gè)切面平均值)，計(jì)算矯正的斑塊面積(斑塊面積/血管管腔面積)。

3.3免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定RYR3蛋白含量 取主動(dòng)脈根部10%甲醛固定、脫水、透明、石蠟包埋，制成厚5 μm組織切片，置于APES防脫玻片上60 ℃烤片固定，脫蠟、水化，3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶5～10 min，蒸餾水洗3次，微波修復(fù)抗原檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)92～98℃,15 min；自然冷卻，PBS洗3次，滴加1∶500的兔抗小鼠RYR3Ⅰ抗(含1%牛血清)4 ℃孵育24 h，PBS洗3次后，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體室溫孵育30 min，滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察顯色變化，約60 s后自來(lái)水終止反應(yīng)。蒸餾水洗，蘇木精復(fù)染2 min，蒸餾水洗5 min，自來(lái)水返藍(lán)，后脫水、透明、封片、鏡檢。實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS緩沖液代替Ⅰ抗作陰性對(duì)照。結(jié)果的判定：光鏡下，陽(yáng)性表達(dá)RYR3的細(xì)胞，胞漿呈黃至棕黃色，RYR3定位于胞漿。定量分析：×200下Leica Q 5501W圖像處理顯微鏡進(jìn)行圖像分析，測(cè)定RYR3蛋白的積分吸光度值，取4個(gè)切面的平均值。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1不同周齡小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的病理結(jié)構(gòu)變化

20周齡ApoE-/-小鼠有纖維斑塊形成，此時(shí)尚有比較完整的纖維帽,內(nèi)含小的脂質(zhì)中心和少量泡沫細(xì)胞,纖維帽主要由VSMCs、彈力纖維和較多的膠原纖維組成。27周齡ApoE-/-小鼠有粥樣斑塊形成，泡沫細(xì)胞堆積，纖維帽變薄，且含有更多的彈力纖維及膠原纖維，部分破裂。33周齡ApoE-/-小鼠粥樣斑塊進(jìn)展明顯,大量泡沫細(xì)胞崩解,深部為大量無(wú)定形壞死物質(zhì),斑塊破裂、管腔狹窄明顯,嚴(yán)重者達(dá)70%～90%。對(duì)照組C57BL/6J各周齡小鼠未見(jiàn)斑塊的形成，中層VSMCs也未發(fā)生明顯變化，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Pathological changes of atherosclerotic plaques in the aorta ofApoE-/-mice (HE staining, ×200). C57BL/6J mice served as controls.

圖1ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的病理變化

2不同周齡ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積的測(cè)定

從20周齡至33周齡動(dòng)態(tài)連續(xù)觀測(cè)結(jié)果看,隨時(shí)間延長(zhǎng),ApoE-/-小鼠的斑塊面積大小及校正斑塊面積的比值呈增長(zhǎng)趨勢(shì),說(shuō)明斑塊增長(zhǎng)與時(shí)間呈正比，見(jiàn)表1。

表1ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積

GroupPlaquearea(mm2)Lumenarea(mm2)Plaquearea/lumenarea20-weekmodel0．035±0．0040．411±0．0110．086±0．00927-weekmodel0．076±0．0040．462±0．0190．164±0．009?33-weekmodel0．132±0．0180．409±0．0320．323±0．037?△

*P<0.05vs20-week model group;△P<0.05vs27-week model group.

3RYR3免疫組化染色測(cè)定

與同周齡C57BL/6J小鼠比較，細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)YR3在ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，隨著ApoE-/-小鼠周齡的增加， RYR3活性和表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表2。

4RYR3含量與斑塊面積之間的相關(guān)性

隨著周齡的增加，RYR3表達(dá)與斑塊面積/管腔面積呈負(fù)相關(guān)(r=-0.652，P<0.01)。

Figure 2. Expression of ryanodine receptor 3 (RYR3) in the aorta of C57BL/6J mice (control group) andApoE-/-mice (model group) (immunohistochemical staining, ×200). Red arrows indicate vascular smooth muscle cells expressing RYR3.

圖2RYR3在小鼠主動(dòng)脈中的表達(dá)

表2RYR3免疫組化染色積分吸光度值

GroupRyanodinereceptor320-weekmodel0．182±0．007#27-weekmodel0．162±0．003?#33-weekmodel0．142±0．004?△#20-weekcontrol0．193±0．00527-weekcontrol0．192±0．00333-weekcontrol0．189±0．002

*P<0.05vs20-week model group;△P<0.05vs27-week model group;#P<0.05vscontrol group at the same age.

討 論

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成以內(nèi)皮功能紊亂為病理學(xué)特征，主要涉及多種危險(xiǎn)因子對(duì)血管內(nèi)皮損傷、源于血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的泡沫細(xì)胞沉著入內(nèi)皮間隙以及血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移等，終致纖維脂質(zhì)斑塊形成。盡管動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的大小決定組織缺血的程度，然而決定動(dòng)脈粥樣硬化最終結(jié)局的卻是斑塊的“行為”。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的組成決定其臨床意義。與穩(wěn)定斑塊相比，不穩(wěn)定斑塊(易于破裂)包含著較高比例的炎癥細(xì)胞及脂質(zhì)和較低比例的VSMCs組成的纖維帽，這些薄纖維帽斑塊的破裂是產(chǎn)生致命性心臟猝死最常見(jiàn)的原因[6]。因此VSMCs是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中最重要的細(xì)胞成分之一，在動(dòng)脈粥樣硬化病程中一旦變化將推動(dòng)其發(fā)生發(fā)展。

VSMCs是組成血管壁的主要細(xì)胞之一，具有非常強(qiáng)的可塑性，能在靜止的分化表型和增殖表型之間轉(zhuǎn)化，Ca2+在這種改變中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度受細(xì)胞膜和肌質(zhì)網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum,SR)膜上的Ca2+通道所調(diào)控。細(xì)胞內(nèi)Ca2+主要貯存于肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，貯存Ca2+的釋放由RYR及IP3R介導(dǎo)，釋放于肌漿內(nèi)的Ca2+在SR Ca2+-ATP酶(SR Ca2+-ATPase, SERCA)的調(diào)控下逆濃度差攝入SR。這樣一來(lái)，由IP3及RYR引起的Ca2+釋放最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+庫(kù)耗竭。細(xì)胞內(nèi)和肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)一定濃度的游離狀態(tài)Ca2+對(duì)于維持VSMCs的增殖和分化至關(guān)重要。游離Ca2+濃度增高促進(jìn)細(xì)胞增殖，但過(guò)度增高甚至肌質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存Ca2+排盡可造成細(xì)胞凋亡。在動(dòng)脈粥樣硬化早期，凋亡頻率非常低，在晚期達(dá)到高峰，伴隨著VSMCs和巨噬細(xì)胞展示凋亡的特性[7-8]，提示VSMCs凋亡可能通過(guò)削弱纖維帽來(lái)促進(jìn)斑塊破裂。

RYR是位于肌質(zhì)網(wǎng)膜上的Ca2+釋放通道，對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度非常敏感：1～10 μmol/L Ca2+濃度使通道激活，大于10 μmol/L Ca2+濃度抑制通道的激活[9]。截止目前，發(fā)現(xiàn) RYR通道有3種亞型：RYR1、RYR2和RYR3。RYR存在于幾乎所有的肌細(xì)胞類型，RYR1主要引起骨骼肌興奮，RYR2實(shí)現(xiàn)心肌收縮，已證實(shí)小鼠VSMCs主要表達(dá)RYR3亞型[10]。當(dāng)Ca2+通過(guò)L型Ca2+通道進(jìn)入細(xì)胞膜時(shí)，激活肌質(zhì)網(wǎng)上的IP3R、RYR1和RYR2，Ca2+從肌質(zhì)網(wǎng)流向細(xì)胞質(zhì)，即鈣觸發(fā)鈣釋放(Ca2+-induced Ca2+release, CICR)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度達(dá)到一定水平時(shí)，肌質(zhì)網(wǎng)上的靠近細(xì)胞膜的RYR3被激活，進(jìn)一步激活該處細(xì)胞膜上的K+通道，引起自發(fā)性短暫性外向性電流(spontaneous transient outward currents,STOCs)的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜電位，使膜復(fù)極化，進(jìn)而使通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的Ca2+減少[11-12]。

本研究表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，ApoE-/-小鼠模型中的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊經(jīng)歷從脂紋、纖維斑塊至粥樣斑塊的不同時(shí)期，且不僅局限于主動(dòng)脈根部，在冠狀動(dòng)脈、主動(dòng)脈弓及其分叉處、頸總動(dòng)脈及其分叉處、胸主動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈、雙腎動(dòng)脈分叉處均可形成斑塊，與人類全身動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的過(guò)程及好發(fā)部位相近[13]，說(shuō)明ApoE-/-小鼠是研究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的可靠模型；且斑塊的組成也發(fā)生了明顯變化，由較低比例的炎癥細(xì)胞、脂質(zhì)和較厚的纖維帽，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楦弑壤难装Y細(xì)胞、脂質(zhì)和較薄的纖維帽。隨著周齡的增加，斑塊面積也逐漸增加。而對(duì)照組C57BL/6J小鼠發(fā)展至脂紋期后幾乎就不再進(jìn)一步發(fā)展，且病變大部分局限于主動(dòng)脈竇部。

且從20周齡～33周齡動(dòng)態(tài)連續(xù)觀測(cè)結(jié)果看,20周齡時(shí)ApoE-/-小鼠RYR3功能開(kāi)始受損，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，其活性逐漸減弱，且與校正斑塊面積呈負(fù)相關(guān)。年幼小鼠體內(nèi)氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)的水平不足以引起RYR功能的改變，然而慢性低水平的 ox-LDL卻削弱了RYR功能的發(fā)揮。這與目前的研究結(jié)論一致[3, 14-15]?？赡艿慕忉屖荝YR3的丟失使VSMCs不能發(fā)揮終止RYR1,2介導(dǎo)的CICR[11]，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)增加。細(xì)胞內(nèi)Ca2+輕度增加可以促進(jìn)增殖，但過(guò)度增高甚至肌質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存Ca2+排盡可造成細(xì)胞凋亡。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的晚期確實(shí)見(jiàn)到VSMCs的大量凋亡，由此推測(cè)，RYR3與VSMCs凋亡密切相關(guān)，且與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成密切相關(guān)。

未來(lái)研究將進(jìn)一步闡述VSMCs凋亡過(guò)程中其它一些鈣離子通道的功能改變及其與RYR3之間的相互關(guān)系,及用特異性作用于這些鈣離子通道的藥物進(jìn)行干預(yù)，以期動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的改變及其與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不良預(yù)后的確切關(guān)系。

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Relationshipbetweencellcalciumiontransporterryanodinereceptor3andatheroscleroticplaqueinapolipoproteinEgene-deficientmice

FENG Li-xia1, GE Chang-jiang1, Lü Shu-zheng1, SUN Hai-mei2, JI Feng-qing2, HUO Yong3

(1DepartmentofCardiology,BeijingAnzhenHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingInstituteofHeart,LungandBloodVesselDiseases,Beijing100029,China;2DepartmentofHistology&Embryology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;3DepartmentofCardiology,theFirstHospital,BeijingUniversity,Beijing100034,China.E-mail:cjge1116@163.com)

AIM: To investigate the change of cell calcium ion transporter ryanodine receptor 3 (RYR3) in the aorta smooth muscle cells of apolipoprotein E gene-deficient (ApoE-/-) mice, and to elucidate the relationship between RYR3 and atherosclerotic plaque inApoE-/-mice.METHODSSix-week-oldApoE-/-mice and wild-type C57BL/6J mice were used in the experiment. The animals were sacrificed for pathological observation at the time points of 20, 27 and 33 weeks after hyperlipidic diet, respectively. Four sections of the aortic root were prepared and HE and immunohistochemical staining were performed. All the sections were analyzed with a computer image analysis system.RESULTSCompared with the controls, the expression of RYR3 was markedly lower inApoE-/-mice (P<0.05). As the age ofApoE-/-mice increasing, the expression of RYR3 decreased significantly, and was negatively correlated to the plaque area corrected by lumen area (r=-0.652,P<0.01).CONCLUSIONCell calcium ion transporter RYR3 participates in the pathological process of atherosclerosis, and is closely related to the formation of atherosclerotic plaques.

Ryanodine receptor 3; Apolipoprotein E; Atherosclerosis

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.026