高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定消炎片中黃芩苷與黃芩素含量

王德寬，皮德艷，潘鵬飛

(1.黑龍江省雞西市疾病預(yù)防控制中心，黑龍江 雞西 158100;2.黑龍江省雞西市皮德艷中醫(yī)皮膚?？漆t(yī)院，黑龍江 雞西 158100)

消炎片由蒲公英、紫花地丁、野菊花、黃芩4味中藥組方，具有抗菌消炎之功效[1]。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)對(duì)黃芩主要成分黃芩苷、黃芩素[2]的定量檢測(cè)，只有黃酮類化合物的理化鑒別。目前，對(duì)消炎片中黃芩苷的高效液相色譜法測(cè)定已有報(bào)道[3-5]，然而黃芩苷在內(nèi)源酶催化水解作用下，會(huì)產(chǎn)生大量的黃芩素[6]，僅以黃芩苷1個(gè)指標(biāo)不能全面評(píng)價(jià)黃芩藥材的質(zhì)量。筆者建立了同時(shí)測(cè)定消炎片中黃芩苷、黃芩素2種主要成分含量的高效液相色譜法，為消炎片中黃芩的質(zhì)量控制提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

HP1100型高效液相色譜儀，包括HP1100工作站、自動(dòng)進(jìn)樣、紫外檢測(cè)器(Agilent公司);CP225D型電子天平(Sartorius公司);KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(常州諾基儀器有限公司);TU-1901型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)為110715-200815，含量為95.2%)、黃芩素對(duì)照品(批號(hào)為111595-200604)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;消炎片(批號(hào)分別為090910，100106，20090103075，均為市售品);其他試劑均為色譜純。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(250 mm ×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)，線性梯度洗脫，0～40 min為40% ～80%A，40～60 min為 80% ～40%A;檢測(cè)波長(zhǎng):277 nm;流速:0.9 mL/min;進(jìn)樣量:5μL;柱溫:35℃。理論板數(shù)以黃芩苷計(jì)不低于12 000，黃芩苷和黃芩素與相鄰峰的分離度均大于1.5。在此條件下的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

分別精密稱取經(jīng)P2O5干燥過(guò)夜的黃芩苷對(duì)照品和黃芩素對(duì)照品14.95 mg和9.10 mg，置同一20 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，用甲醇稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品貯備液。精密稱取樣品適量(約0.5 g)，置50 mL量瓶中，加70%乙醇溶液40 mL，超聲提取40 min，放置至室溫，加70%乙醇溶液至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取5 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。不加黃芩粉末，按消炎片的處方工藝依法制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密量取混合對(duì)照品貯備液0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mL，置 10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣，以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量濃度 X(μg/mL)進(jìn)行回歸分析，得黃芩苷和黃芩素的回歸方程分別為 Y=21.29 X+1.870(r=1.000 0，n=7)，Y=34.94 X-10.72(r=1.000 0，n=7)。結(jié)果表明，黃芩苷與黃芩素進(jìn)樣質(zhì)量濃度分別在7.12～213.5μg/mL和4.55～136.5μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取混合對(duì)照品溶液(黃芩苷、黃芩素質(zhì)量濃度分別為 71.2，45.5 μg/mL)，重復(fù)進(jìn)樣 5 次，每次 5 μL。結(jié)果黃芩苷、黃芩素峰面積值的 RSD分別為0.2%，0.4%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)重復(fù)進(jìn)樣，每次5μL。結(jié)果黃芩苷、黃芩素峰面積的RSD分別為0.5%和0.4%(n=6)，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):分別精密稱取同一批樣品(批號(hào)為090910)5份，依法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果黃芩苷、黃芩素含量的 RSD分別為0.7%和0.9%(n=5)，表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)為090910)0.15 g，6份，分別置25 mL量瓶中，分別精密加入黃芩苷對(duì)照品溶液(2.111 g/L)、黃芩素對(duì)照品溶液(0.705 5 g/L)各2.0 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液并測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批不同廠家的市售樣品，依法制備供試品溶液，平行制備3份，按擬訂的色譜條件測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算黃芩苷和黃芩素的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

采用甲醇和磷酸溶液的梯度洗脫，既縮短了分離時(shí)間，又取得了較好的分離效果，與文獻(xiàn)報(bào)道相同[7]。在試驗(yàn)過(guò)程中，分別比較了超聲提取30 min和回流提取3 h兩種提取方法，以及甲醇、70%乙醇溶液兩種溶劑的提取效果，結(jié)果表明，甲醇作溶劑，超聲提取黃芩苷不完全，加熱回流方法雖然提取完全但比較費(fèi)時(shí)和費(fèi)力。最后選用70%乙醇溶液作溶劑超聲提取30 min，能提取完全。

本品的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)要求較低，不能有效控制消炎片中黃芩的質(zhì)量，很難保證中藥“安全、有效、質(zhì)量可控”。本方法的建立，是對(duì)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的有效補(bǔ)充和提高。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第四冊(cè))[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:152.

[2]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典(下冊(cè))[M].第2版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006:2 806.

[3]馮 丹.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方鼻舒噴霧劑中黃芩苷含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2010，19(12):44.

[4]孟 超，馮紹華.消炎片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房，2008，19(3):207-209.

[5]陳 菲，盛柳青.不同廠家雙黃連口服液的黃芩苷含量比較[J].中國(guó)藥業(yè)，2008，17(6):28.

[6]李建華，王力生，鄒節(jié)明.水提工藝中黃芩內(nèi)源酶降解黃芩苷的研究[J]. 中草藥，2009，40(3):397-400.

[7]靳維榮，石俊英，孫 強(qiáng).HPLC梯度洗脫法測(cè)定山東產(chǎn)黃芩中三種有效成分含量[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，31(2):152-155.